一般來講，細胞轉移最有效的方法是進行低溫保存（-70℃~-196℃），而細胞超低溫保存的基本原理是：當細胞處于-70℃以下環境時，細胞內的酶活性均已停止，即代謝處于完全停止狀態，故而可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~-20℃階段的程序降溫，在此溫度范圍內，冰晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

經過研究人員的長期試驗，發現細胞的凍存及復蘇基本原則是慢凍速融，這樣可以最大限度的保存細胞活力。

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材料準備

1、儀器：凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3、塑料器皿：吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1~2ml）。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、醫用橡皮膏、移液槍。

5、PBS,胎牛血清，DMSO，培養液，雙抗，胰蛋白酶（0.25%）。

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細胞凍存

目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細胞損傷。

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細胞凍存。

2、取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。

3、離心1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml。

5、 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

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6、凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min；當溫度達到-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

細胞復蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2、從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻。

3、離心，1000 rpm，5 min。

4、棄去上層清液，加入含10%胎牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養。

5、次日更換一次培養液，繼續培養。

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注意要點

1、冷凍越慢越好，復蘇越快越好。

2、與液氮接觸的操作，注意戴保護眼鏡和手套。細胞復蘇時，水浴中搖動小瓶易爆炸。且DMSO為有毒致癌品，接觸時帶好手套。

3、凍存細胞數量要足夠，一般最低要達到5x10^6/ml。濃度視情況而定。

4、做好標記：培養瓶上應該用馬克筆做好標記，寫上細胞名稱、代數和凍存時間。

5、對剛復蘇的細胞動作要輕柔，避免細胞破裂。

6、DMSO對大多數細胞不敏感，所以解凍之后不需要除去DMSO，解凍后頻繁換液會慢慢除去DMSO。部分對DMSO敏感的細胞需要除去DMSO。

7、解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清，突然換不一樣的培養液和血清會造成細胞生長不良，甚至死亡。