?免疫組化的介紹
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免疫組化---概念
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免疫組織化學
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? 免疫組化是利用抗原與抗體特異性
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結合的原理，通過化學反應使標記抗體
的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子
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、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗
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原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、
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定性及定量的研究，稱為免疫組織化
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學。
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免疫組化---分類
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根據標記物不同分為：
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免疫熒光法
??????利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。
免疫酶標法
??????基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。
免疫膠體金法
???????用膠體金標記抗體作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。
免疫鐵蛋白法
???????以鐵蛋白標記抗體，鐵蛋白含有2000―3000個鐵原子的致密鐵離子核心，形成四個圓形致密區，所以，具有較高的電子密度，易于電鏡觀察。
***免疫自顯影法
?????同位素標記
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?免疫組化---染色方法
即直接法：
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?????標記物（熒光素和酶等）直接標記特異性抗體
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（一抗），標記抗體和抗原結合
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間接法：
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?????標記物（熒光素和酶等）標記在二抗上，通過一
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抗與抗原結合
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抗體橋法：
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?????標記三抗，二抗為未標記橋抗體
?PAP法（Peroxidase-Antiperoxidase Method?過氧化物酶-抗過氧化物酶）?
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一抗 + 二抗 + PAP復合物（HRP + 抗HRP抗體[與
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一抗統一種屬]）+ HRP底物顯色?
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?SP法（Streptavidin-Peroxidase Methed?鏈霉親和素-過氧化物酶法）
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??? 一抗 + 生物素標記二抗 + HRP標記鏈霉親和
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素 + HRP底物顯色
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?ABC法（Avidin-Biotin-peroxidase Complex Method?親和素-生物素-過氧化物酶復合物）
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?? 一抗 + 生物素標記二抗 + ABC復合物（親和素
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- HRP標記生物素）+ HRP底物顯色
SABC法?(Streptavidin-Biotin-peroxidase
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Complex Methed?鏈霉親和素-生物素-過氧化
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物酶法) ?
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一抗 + 生物素標記二抗 + SABC復合物（鏈霉親和素+ HRP
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標記生物素）+ HRP底物顯色
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免疫組化中常用的組織和細胞標
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本
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?組織標本
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??? -石蠟切片
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??? -冰凍切片
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?細胞標本
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?? -組織印片
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?? -細胞培養片(細胞爬片)
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?? -細胞涂片
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免疫組化實驗流程---石蠟切片、間
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接法
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樣品準備
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取材
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?*標本新鮮：一般在2h以內進行，超過2h，
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組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消
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失，或嚴重彌散。
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?*取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位
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外，還應取病灶與正常交界處，即所取組織
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切片中同時應有抗原陽性和陰性區，以形成
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自身對照。
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?-細胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且
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常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時
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應盡可能避開壞死區。
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固定
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?定義：應用各種方法使組織樣本盡量保持其離體前
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狀態的過程稱為固定（fixation）
。
?固定的作用：從組織學的角度其簡單的定義是，保
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持細胞、組織的固有形態和結構，而從免疫組化技
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術的角度，固定的作用：是使細胞內蛋白質凝
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固，盡量減少或終止外源性酶和內源性酶的反應；
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防止細胞的自溶，以免使抗原擴散至組織間質；以
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保持組織的固有形態和結構；更重要的是保持組織
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或細胞的抗原性，不但要使抗原不導致失活，而且
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不使抗原發生彌散的現象，才能在免疫組化染色
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時，不產生過深的背景，影響對陽性物的判斷
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?組織固定越新鮮越好。組織一經離體，就能及時地
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固定，這是最好的。
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固定液
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對不同類型的組織應適當合理地選擇固定液。固定劑的種
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類繁多，成份復雜，對組織的作用不盡相同。在科研實驗
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中，對于組織的固定，應有針對性的選擇，方能獲得滿意
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的效果。
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??? 較好的固定液應具有強滲透力，能迅速滲入至組織內
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部；其次不會使組織發生過度收縮變形，并能使組織內易
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觀察的成分得以凝固為不溶性物質；還要使組織達到一定
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硬度，有較好的折光率。固定液分為簡單固定液和混合固
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定液
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簡單固定液
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?? 1.?甲醛（formaldehyde）
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??? 是無色氣體，易溶于水成為甲醛溶液。易揮發，且有
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強烈刺激氣味，常用得是37％～40％的甲醛溶液，商品名
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為福爾馬林（formalin）。用作固定的濃度習慣為10％福
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爾馬林，實際含甲醛4％。
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??? 10％福爾馬林滲透力強，固定均勻，對組織收縮少。
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對脂肪、神經及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定
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劑。經福爾馬林固定時間長的組織，易產生黑色的沉淀，
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稱福爾馬林色素，影響染色效果。
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2. 4％中性甲醛固定液：常用的固定液，能滿足常規HE及
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免疫組化工作。中性甲醛是以?pH 7.2～7.4的***酸緩沖液
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為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優
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于一般的4％甲醛固定液。
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? 3.乙醇固定液：使用時以80％～95％的濃度為宜，具有硬
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化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單
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獨使用，
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? 4. 4％?多聚甲醛
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?????? Paraformaldehyde?多聚甲醛?(CH2O)n?易溶于堿性條件
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??????使用PBS配置，可用NaOH 調節PH促溶
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???? 多聚甲醛不穩定，存在解聚的 過程，4度 一兩周之
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內使用完比較好， -20度 一年內不受影響 ，建議現配現
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用。
???? 多聚甲醛易溶于脂類物質，因此能穿過細胞膜進入細
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胞內。用多聚甲醛固定細胞時，能使細胞內的自由氨基基
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團發生化學交聯。當不同的分子發生交聯時，形成一網狀
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結構，把細胞的各個結構成分連接起來。
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免疫組化常用多聚甲醛和中性緩沖甲醛作為固定液；
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混合固定液
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?簡單固定液只是對細胞的某些成分固定較好，而不
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能將所有成分都保存下來。相互配合使用能取長補
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短，得到比較好的固定效果。
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?乙醇一甲醛(乙醇－福爾馬林，AF)固定液：該固
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定液有固定兼脫水作用，固定后的標本可直接入
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95％乙醇脫水。
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?B5(醋酸鈉一升*一甲醛)固定液：多用于固定淋巴
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組織。染色前應進行脫*沉淀處理。
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?Bouin固定液：對組織固定較均勻，收縮很少，不
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會使組織變硬變脆。需現配現用。
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?Carnoy固定液：穿透能力強，可很好的固定細胞
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質和細胞核，特別適合于固定外膜致密的組織，亦
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適用于糖原及尼氏小體的固定。
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?總之固定液的種類很多，需要根據實驗目的來選擇
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合適的固定液。
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