免疫熒光技術操作步驟
一. 直接免疫熒光法測抗原
基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標記抗體用量偏大。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗體溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制
搪瓷桶三只（內有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實驗步驟
1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。
2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一
30min
定時間（參考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗后，再按順序過 0.01mol/L，
pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時振蕩。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++
--++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）
或（-），即可判定為陽性。
注意事項
1. 對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在 1：20-100 之
間，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀釋比例，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，
影響結果的觀察。
2. 染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從 10 min 到數
小時，一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于 37℃可加強染色效果，
但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用 0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染
色過夜較 37℃30 min 效果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染
色的干擾。
（1）標本自發熒光對照：標本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。
（2）特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗
體。
如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光， 待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
4. 一般標本在高壓*燈下照射超過 3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本最好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
二. 間接免疫熒光法測抗原
基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用已知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原（待檢標本）
標本上，在濕盒中 37℃保溫 30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。
第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗 IgG、IgM 抗體（通常為熒光標記的對應二抗）。
如果第一步發生了抗原抗體反應，標記的熒光標記的二抗就會和已結合抗原的抗體進一步結
合，從而可鑒定被檢測抗原。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制。
熒光標記的抗人球蛋白抗體：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋 。
搪瓷桶三只（內有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實驗步驟
1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于未知抗原標本片，10min 后棄去，使標本片保持一定濕度。
2. 滴加以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 適當稀釋抗體，覆蓋未知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫 30min。
3. 取出玻片，置于玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗 1-2 次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 5min，不時振蕩 。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記二
抗
5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫 30min。
6. 重復操作 3。
7. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。
注意事項
1. 熒光染色后一般在 1h 內完成觀察，或于 4℃保存 4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
2. 每次試驗時 ，需設置以下兩種對照：
（1） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物 （需有使用人員自行建立標準）
（2） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光， 待檢標本呈強熒光，則為
特異性陽性染色。
3. 未知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的抗體或熒光標記物，應始終保持在未知抗原標本片上，避免因放置不平使液體
流失，從而造成非特異性熒光染色。
Storage: Store at –20 oC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The
lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater
than a year when kept at -20oC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent
of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 oC.
Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in
human, therapeutic or diagnostic applications.
上海研謹生物http://www.021yjsw.com