?高內涵成像技術在單抗結合檢測中的應用

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優點

?? ? ? ? ? ? ? ??無需沖洗的檢測方法提高效率，減小浪費

???????????? 應用范圍廣，可用于貼壁細胞，懸浮細胞及免疫磁珠

???????????? 可用任何波長的熒光標記

???????????? 高敏感度可檢測低豐度抗原

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單抗結合檢測方法的發展大大提高了細胞及免疫磁珠的高通量，高內涵分析效率。這種不用沖洗，基于熒光微孔分析技術（fluorometric microvolume assay technology, FMAT）的方法可以快速的針對更少量的細胞進行篩選，而且在傳統樣本檢測中由于多次洗板造成的細胞損失也完全可以避免。

?抗體的發現在診斷疾病，研發疫苗和治療疾病的過程中起到重要作用。研究者們利用雜交瘤細胞或者形成克隆來篩選高表達克隆株，檢測細胞表面的抗體結合效率，觀測抗體或配體在細胞內的內化。在傳統的FMAT檢測方法的已有優點之上，利用ImageXpress? Micro 寬場高內涵分析系統進行操作的單抗結合檢測方法可以讓科學家們在同一個平板孔中檢測多種不同細胞的表面抗體結合情況。這一系統也可以將檢測規模提升到1536孔板，并且只需要2-3微升的樣本。即使用更低的二抗濃度，其檢測范圍和靈敏度也不會下降，甚至有所提高。

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檢測原理

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抗體被富集在磁珠上并用帶熒光的二抗進行標記。熒光成像技術可以檢測被磁珠捕獲的抗體數量。利用類似的方法同樣可以檢測細胞表面結合的配體以及配體和抗體的內化。

?在單抗結合檢測過程中（圖1），應將貼壁細胞，懸浮細胞或抗體包被磁珠樣本加入到96,384,1536孔板中。然后加入一抗（目標抗體），接著用二抗對一抗進行標記來檢測一抗的結合情況。

所有的檢測試劑加到微孔板后都無需沖洗。細胞或抗體包被的免疫磁珠被固定在孔板底部表面，即使孔板底部有高背景熒光，陽性信號也可被識別并分析。

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線性和檢測范圍

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在第一個實驗中，我們將不同濃度的一抗滴定使之與7微米的磁珠結合。加入被分析物，用二抗標記并利用ImageXpress ?Micro高內涵分析系統成像。傳統的FMAT檢測方法只能利用紅色（Cy5）通道進行檢測，而IImageXpress ?Micro?系統可以捕捉到多種波長圖像，所以任何二抗標簽都可以用來標記及檢測。在這個滴定實驗中，二抗是用DyLight 488標記的。

?MetaXpress? 高內涵圖像采集和分析軟件中應用Count Nuclei 模塊對圖像進行分析，所得出的最低檢測閾值（LLD）為0.5ng/ml（30pg/well），線性響應大概在1-31ng/ml。此次一抗滴定實驗的曲線顯示出了“前帶現象（prozone）”，以及與單抗結合檢測相關的“鉤狀現象（hook effect）”。在曲線頂峰的信號衰減是由于未結合的一抗在介質中與二抗結合，使之未能與細胞和磁珠結合所致（圖2）。

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免疫磁珠的一抗結合曲線見上圖。12.7微米包被羊抗小鼠抗體的磁珠被結合到不同濃度的小鼠lgG抗體上，并加到微孔板中，在孔板中與標記AlexaFluor488的二抗室溫下共孵育1-2個小時，實驗設四個復孔及同型抗體對照孔。圖像為10X PlanFluor物鏡拍攝?？装宓目s略圖（下）清晰的顯示出抗體結合的濃度梯度。分析結果：LLD 為0.5 ng/mL (30 pg/well)，在1-31ng/mL之間呈線性關系。

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多波長分析更準確的測定細胞響應

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除了熒光圖像外，ImageXpress Micro系統還可以捕捉到透射光圖像（transmitted light, TL）從而更準確的鑒別細胞。在這個基于細胞的檢測例子中，系統同時捕捉了透射光和熒光圖像，并用MetaXpress 軟件的用戶自定義模塊對細胞進行分析。

對同一個孔的熒光圖像觀察顯示抗體已經結合到了細胞表面，但是如果將熒光和透射光圖像疊加就可以看到并非每個細胞都和抗體結合在一起（圖3，左上）。隨后的圖像分析正確的篩選出了與抗體結合的陽性細胞（圖3，右上）。另一個孔的Cy5通道圖像顯示出高熒光信號，意味著抗體的有效結合。然而，通過透射光和熒光的疊加分析可以看出此孔中的細胞并未與熒光有效結合（圖3，左下）。圖像分析確定了這些高熒光信號是由人為因素而非細胞本身引起的，所以這些細胞被標記為未連接到抗體（圖3，右下）。

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上：Cy5（紅色）和透射光（半透明）圖像疊加后顯示出所有抗體結合的陽性和陰性細胞（左）。分析圖中將抗體結合的陰性細胞顯示為黃色，陽性細胞（Cy5通道）顯示為藍色，重疊的部分為白色（右）。

下：Cy5（紅色）和透射光（半透明）圖像疊加后顯示出沒有與細胞重疊的雜質熒光（左）。分析圖中將抗體結合的陰性細胞顯示為黃色， Cy5通道陽性但與細胞無關的雜質顯示為粉色（右）。

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? ? ? ? ??檢測實驗可以很容易的通過優化二抗濃度來確定條件。在這個例子中，我們用三種不同濃度的二抗來結合寬濃度范圍的一抗。就如之前的磁珠檢測結果一樣，實驗顯示出了很好的“鉤狀現象（hook effect）”（圖4，上）。當二抗濃度為0.25μg/mL時的最低檢測閾值為0.5ng/ml，這一數值與標準的FMAT方法一樣。三種濃度的二抗在滴定范圍內都顯示出了良好的線性（圖4，下）。

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上：三種不同濃度二抗的一抗滴定實驗（顯示于X軸）。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 下：結果表明，分析物（一抗）在五倍稀釋梯度下呈線性關系，其LLD為0.5ng/mL

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基于圖像的單抗檢測分析更具靈活性

? ? ? 與傳統的FMAT檢測方法相比，應用ImageXpress Micro系統和 MetaXpress軟件的單抗結合高內涵成像分析方法可以提供更多的信息。本系統可以在消除通常人為誤差的基礎上更快速的得到準確的細胞響應，從而得到更精確的結果。另外，科學家們可以檢測配體與細胞表面的結合并進一步在任意波長檢測二抗標簽，在一個平板上檢測不同細胞以及在不影響靈敏度的情況下將檢測擴展到1536孔板。

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