?1.?對于懸浮細胞：

?

a.?在進行完細胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續Annexin V-FITC的結合。
b.?取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。
c.?加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
d.?加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
e.?室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
f.?如果用于流式細胞儀檢測，可立即上機檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測細胞凋亡的效
果及其驗證請參考圖1和圖2。初次進行流式細胞儀檢測時，建議選擇一組適當的細胞參考圖2設置未染色、PI單染和Annexin V-FITC單染這3個對照。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發現Annexin V-FITC單獨染色時出現了過多的PI假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進行檢測。
2.?對于貼壁細胞的消化后檢測：
a.?把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。注意：對于貼壁細胞，胰酶消化步驟很關鍵。胰酶消化時間如果過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，從而導致細胞壞死的假陽性；消化時間如果過長，同樣易造成細胞膜損傷而出現細胞壞死的假陽性，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。同時，胰酶細胞消化液中應盡量不含EDTA，因為EDTA可能會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結合。
b.?加入步驟2a中收集的細胞培養液，把細胞輕輕吹打下來，轉移到離心管內，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：加入步驟2a中的細胞培養液非常重要，一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-FITC，導致染色失敗。
c.?取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。
d.?加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e.?加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f.?室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
g.?如果用于流式細胞儀檢測，可立即上機檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測的效果及其驗
證請參考圖1和圖2。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin?V-FITC結合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發現Annexin V-FITC單獨染色時出現了過多的PI假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數也無法改善，可以用PBS
將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進行檢測。
3.?對于貼壁細胞的原位熒光檢測：
注：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a.?(選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內。在凋亡誘導結束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000g離心5分鐘。
b.?吸除細胞培養液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。
c.?加入195μl Annexin V-FITC結合液。
d.?加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e.?加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f.?室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。
g.?隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。

圖3. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色效果圖。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC染色陽性細胞，紅色熒光為碘化丙啶染色陽性細胞。僅被綠色熒光染色的為凋亡細胞，被綠色和紅色熒光雙染的是壞死細胞，未被熒光染色的為正常細胞。Vehicle組為陰性對照，Annexin V-FITC染色和碘化丙啶染色都非常弱，L-929細胞處于正常狀態；TSZ組為陽性對照，L-929細胞用TSZ處理3小時。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細胞壞死誘導試劑(C1058)。