加帽反應（反應體系20 μL）
本步驟適用于10μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反應，且可根據實驗需要放大。
1. 取10μg RNA至1.5 mL離心管，使用無核酸酶的水稀釋至9.5 μL；
2. 65℃加熱5 min；
3. 取出離心管置于冰上5 min；
4. 依次加入以下組分：
組分 | 體積 |
Denatured RNA | 9.5 μL |
10×Capping Buffer | 2.0 μL |
Murine RNase inhibitor(40 U/μL) | 0.5 μL |
GTP (10 mM) | 1.0 μL |
SAM (10 mM, fresh) | 1.0 μL |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 5.0 μL |
Cap 2′-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1.0 μL |
【注】：10×Capping Buffer(Cat# 10666)：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C。
5. 37°C孵育2 h；
6. RNA加帽完成，可進行后續實驗。
注意事項
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；
2. 所提取的RNA需經過純化并使用無核酸酶的水重懸；
3. 在加入酶之前需要對RNA溶液進行加熱以去除5'末端的二級結構；
4. 對于已知5'末端結構的RNA，可以延長反應時間至4 h，提高加帽效率；
5. 5'末端標記反應體系中，GTP儲液應稀釋為反應體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。
,產品描述
真核生物中mRNA經轉錄后修飾在5'端形成一個特殊結構，即帽子結構，該結構對mRNA的穩定、轉運與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結構的有效酶，其由D1和D12兩個亞基組成，兼具RNA三***酶活性、鳥苷?；D移酶活性和鳥嘌呤甲基轉移酶活性，可將7-甲基鳥嘌呤帽結構（m7Gppp）連接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合適濃度的加帽緩沖液（Capping buffer），鳥苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在條件下，能夠在一個小時之內對RNA進行加帽，并且保證正確的方向。
本品以無菌液體形式提供，可應用于體內/體外翻譯前mRNA的加帽反應或mRNA的5'末端標記反應。
產品性質
來源（Source） | 攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最適溫度（Optimum Temperature） | 37℃ |
儲存緩沖液（Storage Buffer） | 20mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
活性單位定義（Unit Definition） | 37℃條件下，1小時內將10 pmol GTP（α- 32P）摻入到一條含80個核苷酸（80nt）轉錄產物上所需要的酶量，即為1個單位。 |
產品組分
地 址： 北京市海淀區創客小鎮 聯系人： 魏 電 話： 4008883135 傳 真： 01057187533 Email：customer@bestopbio.com;3007606172@qq.com
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