?使用中空纖維膜反應器進行蛋白質連續高選擇性單PEG修飾
簡介
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PEG修飾通過將聚乙二醇（PEG）偶聯到蛋白質，從而增加蛋白藥物的治療效力，其作用主要體現在：1. 通過增加水力學尺寸，延長體內半衰期；2. 降低給藥頻率，提高患者舒適性；3. 以無免疫原性PEG“遮蔽”抗原位點，降低藥物免疫原性；4. 親水性PEG成分穩定PEG修飾蛋白，降低蛋白質聚集。目前已有數種治療性PEG修飾蛋白藥物獲得FDA批準。
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PEG修飾過程通常使用均相反應器批處理進行，常規的偶聯模式是將PEG偶聯到蛋白質賴氨酸殘基的ε-氨基基團上，但一個蛋白質中一般有多個ε-氨基基團，且由于反應物、產物及副產物的共存，反應液中會混合存在多種不同程度PEG修飾的蛋白質，包括單、雙、三及多PEG修飾蛋白質及其同分異構體。從穩定治療活性及產物精確鑒定方面來講，需要的產物為特定位點單個PEG分子修飾的蛋白質，而由于不同PEG修飾蛋白的理化性質十分相似，所以從混合液中純化單PEG修飾蛋白相當困難。隨著對新型PEG修飾蛋白藥物質量要求的嚴格化，蛋白質PEG修飾過程的選擇性要求日益提高。
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對于提高PEG修飾過程選擇性的關注大多集中于位點特異性的新反應技術，包括N-端PEG修飾、半胱氨酸PEG修飾、組氨酸親和標簽及谷氨酸的PEG修飾等，但這些方法都無法避免多PEG修飾蛋白的形成。另一類方法是通過“物理”途徑來提高PEG修飾過程的選擇性，包括體積排阻反應色譜及固相（“在柱”）PEG修飾，前者將反應物以不同的脈沖注入色譜柱，各反應物及產物因尺寸差異而被“隔開”，且以不同時間洗脫；后者將反應物先后注入固定床，先注入反應物固定在吸附物上，再與后注入反應物反應，然后以特定洗脫方式獲得高純度產物，兩種方法均可提高反應的選擇性，但都局限于小規模的批量處理，不適于規模放大和工業化生產。
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本文旨在介紹一種提高蛋白質單PEG修飾選擇性和程度的新技術，其原理可解釋如下：多數PEG試劑都是“單功能性”的，即一個PEG分子只能偶聯到一個蛋白質分子，而一個蛋白質分子具有多個結合位點，從而偶聯多個PEG。所以，當反應混合物中的PEG含量高于蛋白質含量時，雖然蛋白質的PEG修飾程度會提高，但多PEG修飾蛋白副產物的合成也會提高；而當蛋白質過量時，單PEG修飾的選擇性會提高（選擇性定義為轉化為單PEG修飾蛋白質在所有形式PEG修飾蛋白質中的比例），但蛋白質修飾轉化率降低（轉化率定義為轉化為任一PEG修飾形式的蛋白質的量），即造成蛋白質浪費。在傳統批量反應中，如采用補料分批模式，該情況可有所緩解；但本實驗決定測試一種新型的管狀反應器，即蛋白質在管狀通道內流動，而PEG軸向分散添加（圖1）。如果限制PEG的添加量，且保證蛋白質過量，則可有效提高單PEG修飾蛋白合成的選擇性，并抑制多PEG修飾形式的合成，此外，蛋白質和PEG的添加模式會在管道內形成徑向物質濃度梯度，進一步提高選擇性。與傳統等量液相批量反應模式相比，該模式的單PEG修飾選擇性和程度均可顯著提升。
圖1. 在管狀反應器內，通過在蛋白質溶液軸線分散添加PEG試劑，以增加單PEG修飾選擇性的模式圖。
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基于以上理論，實驗使用中空纖維膜反應器（HMR），其原理如圖2所示。蛋白質溶液從一端泵入纖維內腔，PEG試劑注入殼腔（纖維外腔），沿纖維散狀分布。PEG修飾蛋白合成后，與未反應蛋白和PEG一起，從出口流出。實驗模式蛋白為溶菌酶（MW 14,100； pI 11），PEG為甲氧基-PEG-（CH2）5COO-NHS（5kD PEG等量）。偶聯過程基于酰化作用形成酰胺鍵，即蛋白質置換NHS基團。
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2. 使用中空纖維膜反應器進行蛋白質PEG修飾的模式圖。
2. 使用中空纖維膜反應器進行蛋白質PEG修飾的模式圖。
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實驗
HMR使用MicroKros中空纖維膜組件，產品編號X15S-300-04N，聚砜材質，MWCO 50kD，纖維數量6根，纖維長度20cm，纖維內徑0.5mm，有效膜表面積20cm2。膜MWCO選擇50kD，可允許5kD的PEG自由通過。所有PEG修飾反應在室溫下進行，反應pH為8.0。
圖3. 中空纖維膜反應器實驗設置：1）PEG試劑容器，2）泵，3）流量計，4）壓力傳感器，5）蛋白質容器，6）泵，7）流量計，8）壓力傳感器，9）中空纖維組件，10）UV檢測器，11）樣品采集器。
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實驗使用了批次液相PEG修飾反應作為對照，并測試了不同PEG：溶菌酶摩爾比對反應結果的影響。使用HMR系統進行溶菌酶PEG修飾的過程采用連續模式進行（圖3），同時打開兩個泵，將蛋白質和PEG試劑以恒定流速分別泵入纖維內腔和殼腔，起始反應，產物從出口流出，經UV檢測器后，收集樣品并經SDS-PAGE分析。
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討論
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批量液相PEG修飾反應通常使用過量的PEG試劑，以提高蛋白質PEG修飾程度，但往往導致副產物合成增加；而當蛋白質過量時，雖然單PEG合成的選擇性提高了，修飾轉化率卻顯著降低。結果顯示，在批量液相模式中（PEG：蛋白質摩爾比為4），單PEG修飾蛋白質合成較快（15min以內轉化率0.364，選擇性0.583），但隨反應時間延長，多PEG修飾蛋白質逐漸形成，單PEG修飾蛋白轉化率和選擇性均下降。而如提高蛋白質含量，單PEG修飾蛋白質合成選擇性提高，但轉化率顯著下降；如提高PEG含量，則轉化率提高，選擇性下降，增加后期純化難度。
圖4. 批量液相反應法制備產物SDS-PAGE圖，PEG：溶菌酶摩爾比為4，可見單PEG修飾的選擇性較低。
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實驗測試了HMR模式的不同操作條件，如不同PEG：蛋白質摩爾比、反應（滯留）時間等。在均質液相批量反應器中，反應器內不同部位的反應物及產物濃度不會有顯著差異，而在HMR中，由于設備構造（管狀）和操作模式（分散添加）的原因，會形成反應物/產物濃度梯度，所以反應器內溶菌酶的濃度應表示為總表觀表觀濃度（Capp）：
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圖5. 中空纖維膜反應器法制備產物SDS-PAGE圖，Rapp為0.65，τlm為13.7min，可見單PEG修飾選擇性較高。
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實驗結果說明，PEG試劑沿中空纖維膜分散添加了單PEG修飾的程度和選擇性。溶菌酶、PEG試劑及PEG修飾溶菌酶在單根中空纖維內的分布如圖6所示，中空纖維內反應物和產物的軸向和徑向濃度梯度均有利于提高單PEG修飾的程度和選擇性。由于PEG穿過膜進入膜內腔，其在纖維內壁邊緣流動區域的濃度最高；而溶菌酶在中軸線附近濃度最高，膜內腔液流以“層流”模式流動，故反應物與產物的傳輸主要以擴散方式進行，溶菌酶徑向向外擴散，PEG軸向向內擴散，兩者在某位點相遇并反應，單PEG修飾蛋白質合成后再從該區域向兩個方向擴散。但如上所述，由于流動模式為層流，反應區與中軸線之間的液體流速高于反應區與纖維壁之間的流速，所以單PEG修飾蛋白更多地傾向于“向內”擴散流動，該過程將單PEG修飾蛋白帶離反應區，從而提高反應的選擇性，進而提高轉化率。
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圖6. HMR系統內反應物與產物的軸向及徑向濃度梯度分布。
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由討論可知，使用HMR進行蛋白質PEG修飾相比批次反應釜處理，具有明顯優勢，不僅單PEG修飾的選擇性和程度明顯提高，還可以連續模式進行操作，且規模放大更簡單，即更適于工業化生產。HMR系統也可用于其他需要控制選擇性的化學偶聯反應。
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文獻來源：
Shang X., Ghosh, R., Membrane reactor for continuous and selective protein mono-PEGylation. Journal of Membrane Science, 2014, 451:177-184.
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