3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)試劑盒說明書-軟件手冊-資訊-生物在線

3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)試劑盒說明書

作者：上海雅吉生物科技有限公司 2021-04-20T00:00 (訪問量:5467)

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正式測定前務必取?2-3?個預期差異較大的樣本做預測定測定意義

3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)試劑盒說明書GAPDH?催化?3-磷酸甘油醛氧化生成?1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關鍵酶，與糖異生途徑、體內血糖濃度的維持和糖尿病的發生密切相關，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發揮重要作用。

測定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和?ATP?生成?1,3?二磷酸甘油酸。GAPDH?逆向催化?1,3?二磷酸甘油酸和?NADH?生成?3?磷酸甘油醛、無機磷和NAD，340nm?處測定?NADH?的減少量可反映GADPH?活性的高低。

需自備的儀器和用品

分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96?孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液一：液體?100mL×1?瓶，4℃保存。提取液二：液體?100mL×1?瓶，4℃保存。試劑一：粉劑×1?瓶，-20℃保存；
試劑二：液體?20mL×1?瓶，4℃保存；?試劑三：液體?14uL×1?支，4℃保存；?組織樣本的前處理
①總?GAPDH?酶提?。?/font>建議稱取約?0.1g?樣本，加入?1mL?提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰
浴，200W，破碎?3s，間歇?7s，總時間?1min），然后?4℃，8000g?離心?10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體?GAPDH?酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為?1：5～10的比例（建議稱取約?0.1g?樣本，加入?1mL?提取液一），冰浴勻漿后于?4℃，200g?離心?5min，棄沉淀，取上清在?4℃，8000g?離心?10min，取上清用于測定胞漿?GAPDH?酶活性，取沉淀加?1mL?提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎?3s，間歇?7s，總時間?1min），然后?4℃，8000g?離心?10min，取上清測定葉綠體中?GAPDH?酶活性。
建議測定總?GAPDH?酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的
GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。
細菌或培養細胞的前處理
先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104?個）：提取液一體積（mL）為?500~1000：1?的比例（建議?500?萬細菌或細胞加入?1mL?提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率?20％或?200W，超聲?3s，間隔?10s，重復?30?次）；8000g?4℃離心?10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預熱?30min?以上，調節波長至?340nm，蒸餾水調零。?
2、 樣本測定
  1. 工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或?25℃(?其它物種)預熱?10?分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
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  1. 在試劑三中加入?500μL?蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
  2. 在微量石英比色皿或?96?孔板中加入?5μL?樣本、5μL?試劑三和?190μL?工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄?340nm?處20s?時的吸光值?A1?和?5min20s?后的吸光值?A2，計算?ΔA=A1-A2。

GAPDH?活性計算

  1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
  1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每?mg?組織蛋白每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(V?樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

  1. 按樣本鮮重計算

單位的定義：每?g?組織每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g?鮮重）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(W?×V?樣÷V?樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

  1. 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗?1?nmol?的?NADH?定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104?cell）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(500?×V?樣÷V?樣總) ÷T=2.572×ΔA V?反總：反應體系總體積，2×10-4?L；ε：NADH?摩爾消光系數，6.22×103?L / mol /cm；d：?比色皿光徑，1cm；V?樣：加入樣本體積，0.005?mL；V?樣總：加入提取液體積，1?mL；T：?反應時間，5?min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500?萬。

  1. 用?96?孔板測定的計算公式如下
  1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每?mg?組織蛋白每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(V?樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

  1. 按樣本鮮重計算

單位的定義：每?g?組織每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g?鮮重）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(W?×V?樣÷V?樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

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