一、 DNA甲基化

1.什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶(Dnmt)的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的過程。

2.DNA甲基化與基因表達調控

DNA復制后胞嘧啶的甲基化會改變DNA的構象，使DNA的大溝無法與DNA結合蛋白正常結合，從而使這些非編碼區長期保持無表達活性的狀態。而有轉錄活性的基因可利用非甲基化的啟動子來進行轉錄表達。

3.DNA甲基化主要發生在CpG位點

CpG位點（CpG sites）是指DNA的某個區域，其上的堿基序列以胞嘧啶接著鳥嘌呤出現?！癈pG”是“C—磷酸—G”的縮寫。 CpG位點在人類基因組上并非隨機分布，在人類基因組上的頻率為1%。

??DNA甲基化主要發生在CpG位點。在哺乳動物中，70%到80%的CpG位點的胞嘧啶是甲基化的。

??CpG島是一個富含CpG位點的區域，通常定義為：一個長度至少為200bp的片段

，其GC含量高于60%，主要位于基因的啟動子區（70%的基因）。

二、全基因組甲基化研究策略

優點：通量高 ，全基因組范圍；單堿基分辨率。

缺點：成本高，不適于大樣本研究分析；不適于特異位點、基因或區段研究。

三、特異位點甲基化研究策略

Bisulfite sequencing PCR (BSP): 基因組DNA經亞硫酸氫鹽處理后，設計BSP引物擴增目的片段，最后對PCR產物進行克隆并選取8-10個轉化子序列，即可確定所研究的CpG區域的甲基化頻率。

Methylation specific PCR (MSP) ：首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，然后針對甲基化和非甲基化引物進行PCR擴增，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。

缺點：通量太小、無法精確定量

翼和方法：

Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS)

優勢：BSAS 結合了亞硫酸鹽轉換、靶向擴增子高通量測序技術，可實現多區段、多位點的甲基化精確定量分析。

應用：1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、適用于在大樣本中進一步確認全基因組甲基化研究挑選的陽性位點。

文獻：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160

關鍵點-引物設計

??盡量避免CpG位點，無法避免時，可設計兼并引物；

??經亞硫酸鹽處理后，兩條DNA鏈不再互補，一般需要設計鏈特異性引物用于PCR擴增；

??如果只選一條鏈進行研究，一般選擇正義鏈。

關鍵點-轉換效率

亞硫酸鹽處理是一化學過程，可造成DNA的損傷，很難同時實現100%的轉換效率和保持DNA的完整性，二者需要做出一定的平衡。

轉換效率 = 未轉換堿基讀數/總堿基讀數 【針對DNA序列中的C位點】

如何評估轉換效率？

? 在植物中，葉綠體中不含甲基胞嘧啶 DNA，因此，可用葉綠體DNA序列信息作為內對照，評估轉換效率。

? 在動物中，可通過在試驗中加入未發生甲基化的外源DNA序列（通常為噬菌體DNA）來評估轉換效率；此外，還可利用CpG位點以外的C位點信息來評估。

關鍵點-目的片段富集

采用巢式PCR，確保目的片段有效富集

經亞硫酸鹽處理后，DNA序列復雜度嚴重降低。應嚴格控制建庫PCR的循環數，降低非特異性擴增。

關鍵點-甲基化判斷

通過將參考序列中的C堿基全部替換為T堿基，然后將測序reads比對到轉換后的參考序列上，針對每一個CpG位點，統計C和T堿基的讀數（類似于SNP calling），來判斷該位點的甲基化。

甲基化率：對于每一個CpG位點，甲基化率 = C堿基讀數/該位點測序覆蓋度。

甲基化狀態：利用內對照得出的轉換效率作為期望概率，通過二項分布統計，得到p值，判斷每個CpG位點是否發生甲基化，多位點分析時，通常需要對p值進行矯正（錯誤發生率，FDR）。