網(wǎng)友提出兩個(gè)關(guān)于定量PCR的問(wèn)題：
1.在同一個(gè)反應(yīng)板上，檢測(cè)同一個(gè)基因，但是樣本的起始量不同，比如有的樣本是1個(gè)細(xì)胞，另外一個(gè)是10個(gè)細(xì)胞，對(duì)于這種情況，基線的確定是統(tǒng)一，還是對(duì)于不同起始量采用不同的基線?
2. 在羅氏的儀器中，往往采用3到15循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)偏差10倍作為閾值，為什么取10倍?
現(xiàn)不揣淺陋，作答如下。不當(dāng)之處，歡迎各路大神切磋指教。
1、在同一塊反應(yīng)板上，不同濃度的模板DNA進(jìn)行定量PCR，其CT值不一樣，基線的長(zhǎng)短也不同，有的長(zhǎng)，有的短。典型的情況如下圖：
如果最短的基線長(zhǎng)度也有10個(gè)循環(huán)左右，則所有擴(kuò)增曲線采用同樣的基線，都選用最短的基線以照顧到所有的擴(kuò)增曲線。比如上圖的8組反應(yīng)，可以把基線范圍統(tǒng)一設(shè)定為循環(huán)1-8，而不必單獨(dú)把第8組反應(yīng)的基線設(shè)為循環(huán)1-32。
如果有個(gè)別樣本濃度太高，導(dǎo)致其基線長(zhǎng)度太短，不足以統(tǒng)計(jì)本底信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，則建議把該樣本稀釋10倍或100倍，重新進(jìn)行定量PCR，使其基線長(zhǎng)度增加3個(gè)循環(huán)或者6個(gè)循環(huán)，以求準(zhǔn)確測(cè)定基因拷貝數(shù)。
2、取10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)值，沒(méi)有理論依據(jù)，目的是確保信號(hào)與背景噪音有足夠的區(qū)分度，避免假陽(yáng)性。
如果被檢驗(yàn)的樣本所產(chǎn)生的熒光信號(hào)非常強(qiáng)，則當(dāng)然選取倍數(shù)越高越好。但是倍數(shù)越高，存在越多把弱信號(hào)當(dāng)成噪音給錯(cuò)誤地過(guò)濾掉、造成假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。
綜合權(quán)衡假陽(yáng)性和假陰性的可能性，10倍是一個(gè)在正常實(shí)驗(yàn)條件下能夠照顧到雙方的最佳平衡點(diǎn)，所以大多數(shù)定量PCR檢驗(yàn)都選定10倍SD作為確定閾值的依據(jù)。