• 流式（FC）

　　流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫熒光技術是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優于滴片固定的常規間接免疫熒光的結果。

　　(一)原理

活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。

(二)操作步驟

制備活性高的細胞懸液(培養細胞系、外周血單個核細胞、

胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)

1）用10%FCSRPMI1640調整細胞濃度為5×1000000～1×10000000/ml

2)取40μl細胞懸液加入預先有特異性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl1∶20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清,4℃孵育30min

3）用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min

4）棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖4℃孵育30min

5）用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min

6)加適量固定液(如為FCM制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100～500μl固定液)

7)FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標本在試管中可保存5～7天)

(三)試劑和器材

1.各種特異性單克隆抗體。

2.熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。

3.10%FCSRPMI1640,DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。

4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。

(四)注意事項

1.整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落。

2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。

3.加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4.細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。

附:

1.DPBS(×10,貯存液)

NaCl80g

KCl2g蒸餾水加至1000ml

Na2HPO411.5g臨用時用蒸餾水1∶10稀釋

KH2PO42g

2.洗滌液

DPBS900ml

FCS50ml(終濃度5%)

4%NaN350ml(終濃度0.2%)

3.固定液

DPBS1000ml

葡萄糖20g(終濃度2%)

甲醛10ml

NaN30.2g(終濃度0.02%)

(一)不同來源樣品的處理

1.培養細胞

(1)培養細胞用0.25%的胰酶消化。

(2)PBS或生理鹽水洗滌細胞2次，再用PBS或生理鹽水懸浮細胞，加入預冷的無水乙醇，終濃度為60%～70%，快速混勻，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2.新鮮標本

(1)將標本切成1～2mm3的小塊。

(2)PBS或生理鹽水清洗后去除上清，加入0.2%膠原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10～30min(根據實驗及不同組織確定)，并不斷振動。

(3)300目尼龍篩過濾，除去組織團塊，PBS洗滌2次，300g離心5min，獲得已消化的細胞。

3.石蠟包埋標本

(1)標本在切片機上切取3～5片50μm厚的組織片。

(2)將切片徹底脫蠟，梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸餾水水化。

(3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min，每隔10min振動1次。

(4)過濾，獲得的細胞懸液PBS洗滌2次，300g離心5min。

注意：脫蠟一定要完全(若加入100%乙醇無絮狀物飄起即可);切片厚薄適宜，太薄碎片多，影響FCM分析結果，太厚易造成脫蠟不凈;注意掌握消化時間，避免已釋放的細胞被消化。

(二)直接免疫熒光標記的樣品制備

用標有熒光素的特異抗體對細胞進行直接染色，然后用流式細胞儀檢測，陽性者即表示有相應抗原存在。實驗步驟如下：

1.每份取100μl單細胞懸液(細胞密度約1×106個細胞)。

2.一份加入相應量的FITC或PE標記的特異性熒光直標單抗，另一份加入熒光標記的無關單抗，作為同型對照樣品。

3.室溫下避光反應一定時間(時間長短根據試劑說明書要求進行)，一般在室溫下反應15～30min即可。

4.加入500μlPBS重懸成單細胞懸液即可上機檢測。

(三)間接免疫熒光標記的樣品制備

1.取1×106個細胞/100μl，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應30min。

2.用PBS洗滌細胞2次，離心沉淀棄掉上清液(離心轉數一般為800～1000rpm，5min)。

3.用100μlPBS重懸細胞，再加入FITC或PE標記熒光二抗(用量均按說明書要求加入)混勻，室溫下反應30min。

4.用PBS再洗滌細胞2次，加入500μlPBS重懸成單細胞懸液，上機檢測。

注意：以上兩種染色方法的抗體加入量和反應時間，一般根據試劑使用說明書的要求進行。若說明書上未說明，應先進行預實驗，掌握好劑量與最佳反應時間后，再進行流式樣品的制備。制備好的樣品，若不能及時上機檢測，用1%～4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

(四)DNA熒光染色的樣品制備

DNA是細胞內含量比較恒定的參量，隨著細胞增殖周期的各時相而發生變化。熒光染料(如PI)可選擇性地定量嵌入核酸(DNA/RNA)的雙螺旋堿基之間，與細胞特異性結合，DNA含量與熒光染料的結合量成正比，因此通過測定熒光強度可獲知細胞的增殖情況。

1.將固定過的細胞離心(500～1000rpm，5min)棄上清液，再用PBS洗滌2次。

2.用PBS調整細胞濃度，每份為1×106個細胞/100μl。

3.加入1000μlDNA熒光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色試劑盒)，室溫下避光染色15min。

4.上流式細胞儀檢測。

以上樣品的制備可分析細胞周期各時相的百分比，同時可粗略觀察有無凋亡細胞現象，如果用對照液(雞紅細胞)作參照標準，可進行細胞DNA倍體分析，通過DNA指數(DNAindex，DI)衡量DNA的相對含量，DI可用下式計算：

DI=樣品G0/G1期的均值/正常二倍體細胞G0/G1期均值

樣品制備應注意的問題和影響因素

1.樣品制備應注意的問題

(1)單細胞懸液的制備是流式細胞術分析的關鍵。如遇有細胞團塊應先用300～500目的細胞篩網過濾后，再上機檢測。

(2)標本采集后要及時固定或深低溫保存，手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血與壞死組織。

(3)免疫熒光標本應注意死細胞和碎片的去除，要求每份樣品中雜質、碎片、團塊重疊細胞應<2%，尤其是稀少細胞或細胞亞群的測定時，否則這些細胞的非特異性熒光增加，會干擾免疫熒光測定。

(4)細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度，一般每份樣品要求的細胞數為5×105/ml～1×106/ml，對腫瘤細胞DNA異倍體的樣品分析，至少應有20%的腫瘤細胞存在(占主峰1/5以上的異倍體才可確認為異倍體峰)。

(5)石蠟包埋組織單細胞制備時要注意：選取含待測細胞豐富的區域;石蠟組織片的厚度要適宜，最好為40～50μm;徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性;充分水化，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態。

2.影響樣品制備的因素

(1)溫度對熒光強度的影響：一般認為，溫度升高時熒光減弱，所以在熒光測量時要保持染色后的樣品在適當低溫環境下進行，并盡可能減少樣品的光照射時間。有條件時，應使樣品觀察室做到恒溫裝備，使溫度對熒光染色的影響減少到最小，會得到更好的熒光定量測定的結果。

(2)pH值對熒光強度的影響：每一種熒光染料分子發光的最高量子產額，都有自己最適合的pH值，以保持熒光燃料分子與溶劑間的電離平衡，如果pH值發生改變，可能造成熒光光譜的改變，如FITC在酸性溶劑中呈藍色熒光，為陽離子發光;在堿性溶劑中呈黃綠色熒光，為陰離子發光。

同型對照

1、同型對照不是萬能的。同型對照雖然與試驗抗體是同種型，而且具有相同的熒光標記，但不一定是同一廠家生產的，肯定不是同一批次的，也很難保證每個抗體上標記的熒光分子的數目是相同的，所以很多情況下發現用同型對照調的參數并不合適。

2、是否需要同型對照取決于要檢測的指標。

(1)對于一些細胞特異性的亞群標志，比如CD3/4/8這些，對于某一細胞來說它或者表達，或者不表達，這時只要抗體和標記技術沒問題都會清晰分群，無需同型對照，甚至不需要陰性對照。

(2)某些分子在細胞上原本不表達，或表達極低，加入處理因素后表達明顯上調，這種通常也能明顯分群，也不需要同型對照，但要有未加處理因素的陰性對照。檢測細胞表面活化分子的表達，細胞內因子檢測等通常是這種情況。

(3)如果細胞群中大部分細胞都表達要檢測的目標分子，只是有的表達高些，有的表達低些，通常細胞不能明顯分群。此時通常需要以同型對照做參考，雖然它也不一定百分之百正確。

IgG-FITC同型(IgG1orIgG2aorIgG2b,etc.)

封閉情況

對于表面分子，可以不設同型對照，對于細胞內細胞因子，應設同型對照，有利于對照陽性染色是否成功，以及分析時設定gate。如果是micecell,實在不設也可以，目前為止，我看Isotype似乎都沒反應。

如果嚴謹的做流式,都是應該做同型對照的,據我們自已做的經驗,特別是以下幾種情況最好是做同型對照:

1自已標記的抗體:許多做單抗實驗室自已標記抗體的(國內許多數一數二的抗體實驗室在內),但這種自已標記的抗體,我們做同型對照經常會與不做同型有很大的區別

2一些表達比較低的分子:有些表達比較低的分子,特別是表面分子,做同型后的結果甚至會出現陽性與陰性之間的明顯差異,這種事我們也經歷過多次了.

熒光標記一抗的同型對照抗體只是缺了決定特異結合的Fc段。非熒光標記一抗的同型對照更簡單，就是熒光二抗。

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用(5%)。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。

脫脂牛奶，BSA，或者FCS，在ELISA及WB中用它們主要有兩個原因：

一是它們做為隋性蛋白，用來封閉酶標板或膜上的蛋白結合位點，使其后的蛋白不會因為非特異結合而影響本底(即所謂封閉);

二是在抗體等蛋白稀釋到很低濃度時會不穩定，它們可以起到保護，或穩定的作用，基本上可以理解為競爭關系。

封閉是沒有特異性的，所有的抗原表位都被結合了。

但非特異性結合容易被競爭替換，而特異性結合很難被競爭替換。

所以封閉主要是針對一抗的，沒有對二抗封閉的。