1,用特殊的微孔板作為測定板,用親和素包被微孔板,然后用生物素標記探針的3端,再通過該生物素和包被在微孔板上的親和素發生連接,將探針固定在微孔板上,形成一個固相捕獲系統.注意:探針5端和待檢靶序列5端的一段要互補.
2,在擴增時,引物用抗原(生物素,地高辛或熒光素酶等)標記,這樣擴增產物中就會滲入抗原.
3,PCR擴增產物與微孔板上的探針雜交,從而捕獲被測靶序列,由于擴增產物中已經滲入抗原,在微孔中加入HRP標記抗體后,酶標抗體就與靶序列的抗原免疫結合,最后加入酶底物進行酶促顯色,通過光密度測定實現精確定量.
PCR-ELISA比PCR本身在病毒分型,基因多態性分析與克隆鑒定等方面有其獨特的優勢.另外,不應用同位素標記,因而避免了放射性帶來的危害,而且整個實驗周期僅需6h左右,較Southern blot雜交大為縮短實驗時間,操作簡便,可用于大量標本的檢測.盡管與熒光素染色凝膠電泳相比較,PCR-ELISA檢測結果的特異性,靈敏性和準確性有顯著的提高,但是ELISA基本上是一個開放性的反應系統,特別是在洗滌ELISA反應板時,很容易造成污染,從而引起假陽性.因此,在PCR-ELISA整個實驗過程中,必須進行嚴格的無菌操作.同是,PCR-ELISA對PCR產物和探針的雜交條件(PCR產物的稀釋度,雜交溫度和時間)要求嚴格.
免疫酶技術和其他技術進行綜合和交叉,是這個發展過程的明顯特點.值得注意的是,電子計算機科學技術,分子生物學,物理學,化學,材料科學和數學等科學技術的發展都將影響免疫酶技術的發展.今后,免疫酶技術很有可能和電子計算機科學技術,生物體數量基因調控的深入提示以及物理化學特殊新型材料形成新滲透和綜合,使人類對生物科學的研究以及對病原體,細菌與病毒及相關產物的檢測和研究達到前所未有的深度和高度.
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