色譜分析技術(shù)
高壓液相色譜
Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色譜的設(shè)想，然而直到六十年代后期，由于各種技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜才付諸實(shí)現(xiàn)。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名稱是高效液相色譜（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色譜已經(jīng)廣泛地應(yīng)用，成為一項(xiàng)不可缺少的技術(shù)。它的主要優(yōu)點(diǎn)是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復(fù)性高；⑷高效相色譜柱可反復(fù)使用；⑸自動(dòng)化操作，分析精確度高。根據(jù)分離過(guò)程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個(gè)基本類型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機(jī)酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產(chǎn)物；⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽；⑽脂類等。
一、分類
高效液相色譜法可分為四個(gè)基本類型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。
（一）液－固色譜法
液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對(duì)溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個(gè)硅脫表面的，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強(qiáng)烈相互作用，這些區(qū)域?yàn)榛钚晕恢茫枘z與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強(qiáng)，而化合物在硅膠柱上的滯留時(shí)間也長(zhǎng)。在液－固色譜中，依靠流動(dòng)相溶劑分子與溶質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相互活性位置， 從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來(lái)。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強(qiáng)的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強(qiáng)，因而稱強(qiáng)溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點(diǎn)是適于分離色譜幾何異構(gòu)體，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。
（二）鍵合相色譜法
鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來(lái)的。鍵合相色譜法將固定相共價(jià)結(jié)合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動(dòng)中有微量溶解，及流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點(diǎn)。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
在正常相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如一級(jí)氨基、*基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，它不適于分離幾何異構(gòu)體。
2.反相色譜法
在反相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔铮缯粱取Ａ鲃?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。反相色譜法在高效液相色譜法中應(yīng)用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用 、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用， 因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去。可見(jiàn)反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去，在色譜柱中滯留時(shí)間也長(zhǎng)，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物，亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團(tuán)的化合物。可以通過(guò)改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長(zhǎng)短不同，最長(zhǎng)的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L(zhǎng)的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)來(lái)選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔铮苜|(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說(shuō)疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性降低而增加。水是極性最強(qiáng)的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙*，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用極廣。可用于①氨基酸和多肽的分析；②蛋白質(zhì)的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。
（三）離子交換色譜
離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)， 這些帶電基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時(shí)候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來(lái)與流動(dòng)相交換的離子就是陽(yáng)離子，這種離子交換劑叫做陽(yáng)離子交換劑。陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是－NH2，及－MH3+ ：陽(yáng)離子交換劑的功能團(tuán)主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們?cè)诤軓V泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH 離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。
二、易出現(xiàn)的問(wèn)題
（一）渦流擴(kuò)散（Eddy diffusion）
流動(dòng)相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細(xì)溝，則流動(dòng)相的速度就快；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效率高。
（二）分子擴(kuò)散（Molecular diffusion）
分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動(dòng)，也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時(shí)在操作時(shí)，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時(shí)間長(zhǎng)，則擴(kuò)散嚴(yán)重。
（三）質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）
被分離物質(zhì)要在流動(dòng)相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個(gè)液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時(shí)間。當(dāng)流速快時(shí)，轉(zhuǎn)移速度慢，來(lái)不及達(dá)到平衡動(dòng)相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動(dòng)，使區(qū)帶變寬。
（四）動(dòng)相流速
當(dāng)流速太低時(shí)，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對(duì)流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當(dāng)達(dá)到最低值時(shí)，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過(guò)濾色譜中，因?yàn)槲镔|(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速咖大會(huì)降低柱效率。
（五）固定相顆粒大小
定相顆粒越小柱效率越高，對(duì)流動(dòng)相流動(dòng)的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動(dòng)。
親和色譜法
一、 基本理論
（一）原理：在生物體內(nèi)，許多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有與某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補(bǔ)的DNA等，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結(jié)合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理，建立起來(lái)的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個(gè)進(jìn)行專一結(jié)合的分子互稱對(duì)方為配基。如抗原和抗體，抗原可認(rèn)為是抗體的配基，反之抗體也可認(rèn)為是抗原的配基。將一個(gè)水溶性配基在不傷害其生物學(xué)功能的情況下與水不溶性載體結(jié)合稱為配基的固相化。親和色譜法的基本過(guò)程是： 1.配基固相化。將與純化對(duì)象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和性）。 2.親和吸附。將含有純化對(duì)象的混合物通過(guò)親和柱，純化對(duì)象吸附在柱上，其他物質(zhì)流出色譜柱。 3.解吸附。用某種緩沖液或溶液通過(guò)親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質(zhì)洗脫出來(lái)。
（二）應(yīng)用范圍親和色譜可用于下列生物體系：酶：底物、抑制劑、輔酶抗體：抗原、病毒、細(xì)胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞核酸：互補(bǔ)堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶 、結(jié)合蛋白激素及維生素：受體、載體蛋白細(xì)胞：細(xì)胞表面特異蛋白、外源凝集素親和色譜的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、效率高、條件溫和，缺點(diǎn)是使用局限性大。
（三）載體的選擇原則用于親和色譜的理想載體應(yīng)具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容許大分子自由通過(guò)；⑶有一定硬度，最好為均一的珠狀；⑷具有大量可供反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，能與大量配基共價(jià)連接；⑸非特異性吸附能力極低；⑹能抗微生物和酶的侵蝕；⑺有較好的化學(xué)穩(wěn)定性；⑻親水性。選擇配基根據(jù)對(duì)純化大分子的特異性的全面認(rèn)識(shí)。選擇也的配基有兩條標(biāo)準(zhǔn)：第一是蛋白質(zhì)和配基之間必須有強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)在5mM以上不是好配基； 相反親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x蛋白質(zhì)──配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使蛋白質(zhì)變性。例如用抗生物素蛋白作配基純化含生物素的羧化酶時(shí)，生物素──抗生物素蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)達(dá)10-15M，解離時(shí)需要pH1.5，6M鹽酸胍，在這種條件中。羧化酶大多數(shù)已經(jīng)變性。選擇配基的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是，配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與蛋白質(zhì)之間特異結(jié)合，但可用于活化和載體相連接，同時(shí)又不影響配基與蛋白質(zhì)之間的親和力。
（四）常見(jiàn)載體的特性瓊脂糖凝膠： 親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定 （商品名：Sepharose） 聚丙烯酰胺凝膠： 理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐有機(jī)溶劑及去污劑， 抗微生物能力強(qiáng)， 特別適應(yīng)用配基與提取物親和力比較弱的物質(zhì)。葡聚糖凝膠： 有良好的化學(xué)及物理性質(zhì)，孔經(jīng)小。 纖維素： 非特易吸附嚴(yán)重，廉價(jià)，易得。
二、實(shí)驗(yàn)方法 親和色譜分離的方法隨每種分離物質(zhì)的不同而有不同。一般推薦使用的程序如下： 1選擇配基；2選擇偶聯(lián)凝膠；3偶聯(lián)配基；4裝填合適的柱；5平衡（2-3倍體積緩沖液）；6應(yīng)用樣品；7洗滌未結(jié)合物質(zhì)；8洗脫結(jié)合物質(zhì)→除鹽；9再生
吸附色譜法
吸附色譜法常叫做液－固色譜法（Liquid-Solid Chromatography，簡(jiǎn)稱LSC），它是基于在溶質(zhì)和用作固定固體吸附劑上的固定活性位點(diǎn)之間的相互作用。可以將吸附劑裝填于柱中、覆蓋于板上、或浸漬于多孔濾紙中。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，例如硅膠、氧化鋁和活性炭等。活性點(diǎn)位例如硅膠的表面硅烷醇，一般與待分離化合物的極性官能團(tuán)相互作用。分子的非極性部分（例如烴）對(duì)分離只有較小影響，所以液－固色譜法十分適于分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。