? ? ? ?受自然界細(xì)菌的CRISPR系統(tǒng)啟發(fā)，科學(xué)家們利用蛋白Cas9實現(xiàn)了對DNA序列的切除，極大地簡化了DNA編輯過程，CRISPR-Cas9的基因組編輯技術(shù)迅速成為生命科學(xué)中最熱門的技術(shù)。2017年，美國東部時間10月25日，《Science》和《Nature》兩大權(quán)威雜志上先后公布了兩項關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的最新研究成果，引起了科學(xué)界廣泛的轟動。且CRISPR-Cas9更正了傳統(tǒng)基因療法的不足，能用正確序列替換“壞”基因，直接修復(fù)細(xì)胞的基因缺陷，減少了外源基因進入錯誤位點的可能，為很多疾病的治療帶來了新的展望。
? ? ? ?而對于基因編輯的研究主要還停留在單基因修飾引起的下游基因表達(dá)整體變化。但是一個表型的出現(xiàn)往往是多個基因聯(lián)合作用的結(jié)果，且一次基因編輯會引起不同的細(xì)胞產(chǎn)生不同的反應(yīng)。那么如何來解析這復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基因編輯聯(lián)合群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序為我們解析復(fù)雜的生命現(xiàn)象帶來了新的曙光。
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? ? ? ?10X ChromiumTM Single Cell 3'Solution作為一個高通量的單細(xì)胞測序技術(shù)，全面剖析細(xì)胞的異質(zhì)性，幫助鑒定基因編輯引起不同細(xì)胞群體發(fā)生的變化。
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今天小編就來給大家分享一篇《Cell》文章，帶大家了解如何把混亂的基因編輯結(jié)果屢清楚。
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案 例
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Perturb-Seq：混合基因篩選后通過群體單細(xì)胞RNA測序解析混合分子作用環(huán)路
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Perturb-Seq:Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA ProfilingofPooled Genetic Screens
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期刊：《Cell》發(fā)表時間：2016.12 影響因子：28.71 發(fā)表單位：麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)劍橋?qū)W院
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? ? ? ?基因篩選可以幫助推斷哺乳動物細(xì)胞中的基因功能，但是仍然很難規(guī)模化分析復(fù)雜的表型，比如轉(zhuǎn)錄圖譜。基因篩選系統(tǒng)分析了基因編輯對哺乳動物細(xì)胞功能的影響，但一般每次基因編輯都單獨開展，目前在哺乳動物的細(xì)胞中還沒有研究過幾百個基因編輯同時開展對轉(zhuǎn)錄組整體變化的影響。然而本文通過聯(lián)合CRISPR-Cas9和基于10X Genomics平臺的群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，準(zhǔn)確識別目的基因，分析基因修飾對細(xì)胞狀態(tài)的影響并探索這些基因如何產(chǎn)生相互作用和依賴。
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?2.1 聯(lián)合CRISPR編輯和10X ChromiumTM Single Cell 3'Solution群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建Perturb-Seq；
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2.2 使用Perturb-seq技術(shù)對一共200,000個BMDCs、K562細(xì)胞進行檢測，評估一類轉(zhuǎn)錄因子對脂多糖（LPS）引起樹突細(xì)胞（DC）反應(yīng)的調(diào)控。
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?3.1 混合CRISPR篩選和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建Perturb-Seq技術(shù)
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? ? ? ?搭建Perturb-seq，連接了CRISPR篩選和單細(xì)胞測序，通過GBC識別干擾。首先構(gòu)建編碼sgRNAs的慢病毒混合物，然后去感染免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞，構(gòu)建基因干擾的細(xì)胞庫，并通過標(biāo)簽GBC來識別sgRNA。接下來通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序來追蹤細(xì)胞的增長、分化、和/或?qū)Υ碳さ姆磻?yīng)。
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圖1 Perturb-seq搭建流程示意圖
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3.2 構(gòu)建單細(xì)胞干擾帶來的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的計算模型
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? ? ? ?該研究建立了MIMOSCA計算模型，其依賴于線性模型，來評估干擾對于基因表達(dá)的影響。我們用彈性正則化擬合系數(shù)矩陣，減少假設(shè)檢驗的次數(shù)，解決相關(guān)協(xié)變量和噪聲數(shù)據(jù)。我們用置換測試來評估每個系數(shù)的重要性，通過反復(fù)修正，使得模型的干擾與細(xì)胞的表型相匹配（圖2）。
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圖2 MIMOSCA計算模型
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3.3 通過Perturb-seq解析BMDC對LPS反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄程序
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? ? ? ?分析了BMDCs中24個轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)，來展示Perturb-seq如何發(fā)現(xiàn)正確的基因。我們培養(yǎng)了Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞，然后2天后感染混合了24個靶向轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒。7天后使用LPS刺激細(xì)胞，收集刺激前和刺激后3小時的數(shù)據(jù)進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析。
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? ? ? ?接下來分析了干擾的每個轉(zhuǎn)錄因子對每個基因的影響，通過類似的調(diào)控作用將轉(zhuǎn)錄因子分配到模塊中，并將基因按照如何被干擾影響分到不同的模塊中。其中轉(zhuǎn)錄因子分為M1-M4四個模塊，分別代表了其帶來的不同影響，基因分為P1-P5五個模塊，代表了不同的生物過程（圖3）。得到分析結(jié)果也得到了Chip-seq實驗的驗證（圖4）。
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轉(zhuǎn)錄因子模塊控制轉(zhuǎn)錄程序的網(wǎng)絡(luò)圖
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Chip-seq對Perturb-seq結(jié)果的驗證
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3.4 遺傳相互作用影響基因表達(dá)和細(xì)胞整體狀態(tài)
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? ? ? ?接下來該研究評估遺傳的相互作用對于基因的影響，對于每一個被干擾的轉(zhuǎn)錄因子， 我們評估了靶基因的相對比例，比如他們的關(guān)系是單獨附加的（無相互作用）、協(xié)同、緩存還是主導(dǎo)（比如兩個轉(zhuǎn)錄因子相反的作用，但是相互作用而提高了他們中的一個）。其中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子對（如Runx1、Irf1、Irf2或Irf4）都發(fā)揮遞增作用，只有Nfkb1 (Stat1-Nfkb1, Stat3- Nfkb1,Rela-Nfkb1, Spi1-Nfkb1) 發(fā)揮緩沖作用（圖5）。
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圖5 BMDC中轉(zhuǎn)錄因子的遺傳互作
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3.5 K562細(xì)胞的整體轉(zhuǎn)錄模塊和特異性轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)
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? ? ? ?接下來該研究對K562細(xì)胞中的10個轉(zhuǎn)錄因子進了Perturb-seq，在考慮細(xì)胞狀態(tài)協(xié)變量的情況下擬合線性模型。
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圖6 K562細(xì)胞中非必需轉(zhuǎn)錄因子的Perturb-Seq模式圖
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3.6 細(xì)胞周期調(diào)控因子的干擾揭示了相似的適應(yīng)性效應(yīng)和有絲分裂阻滯的不同輪廓
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? ? ? ?我們針對K562細(xì)胞中的13個基因進行了干擾，這13個基因之前的研究被證實抑制了有絲分裂的過程。使用STAR方法來構(gòu)建模型，所預(yù)測的結(jié)果與之前文獻的報道也是一致的。
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? ? ? ?本文將CRISPR基因編輯方法，與基于10X Genomics平臺的群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法相結(jié)合，構(gòu)建了Perturb-seq，來同時分析多重遺傳干擾后的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。Perturb-seq降低了大量復(fù)雜擾動作用的分析時間和分析成本。
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10X ChromiumTM Single Cell 3'Solution作為高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可以幫助我們更省時省力省錢的開展群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的研究。作為國內(nèi)第一家引進10X Genomics平臺的公司，博奧晶典率先推出了10X ChromiumTM Single Cell 3'Solution平臺服務(wù)，并完成了人和小鼠的肝臟、肺臟、皮膚、心臟、腦、腎臟、血液、卵巢、神經(jīng)，以及雞、斑馬魚、水稻、擬南芥、油菜、白菜等動植物的單細(xì)胞測序，擁有豐富的項目經(jīng)驗。
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參考文獻：
[1] Atray Dixitet al., Perturb-Seq:Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA ProfilingofPooled Genetic Screens (2016). Cell. IF:28.17.
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博奧晶典科研服務(wù)事業(yè)部 商桂娜、王美靜、李媛媛 | 文案
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