3D打印高分辨率圖案化細胞結構-技術前沿-資訊-生物在線

3D打印高分辨率圖案化細胞結構

作者：上海睿度光電科技有限公司 2021-09-15T00:00 (訪問量:9639)

 

生物打印是一種用于制造活組織的新興技術，它允許將細胞排列在預定的3D結構中。然而，包含多種細胞類型的高分辨率生物打印結構的例子有限。一種低成本工藝被提出，該工藝采用含有哺乳動物細胞的液滴的3D打印，以在油中產生堅固的、有圖案的構造，并將其可重復地轉移到培養基中。以組織相關密度（107個細胞/mL) 和1nL的高液滴分辨率。打印出具有≤200μm特征的高分辨率3D幾何圖形；這些包括一個樹枝狀細胞連接、一個對角平面連接和一個骨軟骨界面。打印的細胞顯示出高活力（平均90%），打印結構內的HEK細胞在培養條件下增殖。值得注意的是，一項組織工程研究表明，打印的oMSCs可以沿軟骨細胞譜系分化，以產生含有II型膠原蛋白的軟骨樣結構。

 

大多數組織由多種細胞類型組成，這些細胞類型以細胞間通訊和功能所需的3D排列方式組織。體外活組織的制造涉及重現這種復雜的細胞結構，這很難以受控方式進行。然而，現在的細胞打印技術和3D細胞培養技術的發展使得簡單組織能夠從打印的細胞構建體成熟，這些細胞構建體是一種或多種細胞的3D組織。具有生理形態和復雜性的人造組織已用于外科植入、毒理學和腫瘤模型。在“High-Resolution Patterned Cellular Constructs by Droplet-Based 3D Printing”的研究中，研究團隊將以前用于3D打印具有組織樣功能的水滴網絡的方法擴展到活細胞的高分辨率圖案。此外，這種低成本方法能夠在組織相關細胞密度下重復打印具有高細胞活力的3D構建體，液滴分配體積低至1nL，即液滴分辨率介于傳統噴墨打印機和基于閥門的生物打印機之間。
研究團隊使用了一種單液滴具有1nL液滴分辨率的高精度細胞打印方法（這種生物打印方法，通?？梢岳肐nkjet技術或者EHD噴墨打印技術來實現，這兩種打印方法，RUIDU都可提供高精度的打印系統，以及成熟的技術支持）。浸入油中的打印細胞結構隨后被封裝在凝膠薄層中，以轉移到水性介質中。通過這種方式，研究團隊從兩組細胞中生成了圖案結構，具有高分辨率3D特征，包括寬度低于200μm的層和通道，在堅固的立方毫米尺度結構內。摻入的細胞最初顯示出高活力（平均90%）并且以107個細胞/mL的組織樣密度存在，即與基于液滴的生物打印過程的最高報告密度相同。細胞增殖發生在幾天內，同時細胞活力總體增加（平均>95%）。值得注意的是，打印結構中的綿羊間充質干細胞（oMSCs）對轉化生長因子-β3（TGF-β3）有反應并經歷分化以形成軟骨樣結構。這些數據表明，基本的生物過程在打印后可以保持完整，表明這里介紹的方法將適用于復雜的組織制造。

細胞結構的3D打印

細胞結構的高分辨率制造是通過使用3D打印機實現的，該打印機以前用于打印被油中脂質單層包圍的水滴。打印機修改允許加載在液滴內的哺乳動物細胞在基于水凝膠的生物墨水中進行圖案化（圖1和2，方法）。然后將打印的細胞構建體封裝在凝膠薄層中以允許轉移到水性介質中（圖3）。選擇人胚腎（HEK-293T）細胞衍生物（補充方法）來評估打印方法，而oMSCs用于研究打印構建體中細胞的分化能力。
 
▲ 圖1 細胞結構的3D打印。（a）細胞打印示意圖。分配噴嘴將含有細胞的生物墨水液滴噴射到含有脂質的油中。油滴通過油容器的程序運動定位。液滴通過形成液滴界面脂質雙層而凝聚。（b）共聚焦熒光顯微照片顯示無細胞打印結構內的液滴界面雙層（染成黃色）（11×14×7個液滴）。通過向打印溶液中添加sulforhodamine-101（~10μM）來觀察雙層。（比例尺=100μm）。（c）直方圖顯示油下打印液滴中的平均HEK-293T細胞密度作為生物墨水中細胞密度的函數。細胞密度計算為每個液滴的平均細胞數（n=25）除以平均液滴體積。誤差棒代表液滴尺寸方差和每個液滴方差的單元格的復合誤差。（d）包含兩種細胞類型的圖案化細胞結的明場顯微照片，打印為從兩個玻璃噴嘴（d=~150μm）噴出的1nL 液滴（d=130μm）的連續層。（e）油下打印的HEK-293T細胞構建體（11×14×2液滴）的共聚焦熒光顯微照片。分別用鈣黃綠素-AM（CAM，綠色）和碘化丙啶（PI，紅色）進行活/死細胞染色。可見大約700個細胞，4×107個細胞/mL，存活率為85%（通過手動細胞計數確定）。（比例尺=150μm）。（f）在HEK-293T細胞構建體（7×8×4液滴）上進行的活/死測定的高倍放大共聚焦熒光顯微照片，打印起始濃度為1.5×107個細胞/mL，平均占用率每滴38個細胞相當于3×107個細胞/mL。可以看到一些液滴邊界。（比例尺=75μm）。
 
▲ 圖2 兩種細胞類型的高分辨率圖案。（a-c, e,f）打印后立即在油中打印細胞結構的共聚焦熒光顯微照片。用深紅色（DR）或紅色 CMPTX（RC）CellTracker™染料染色的HEK-293細胞分別呈藍色和黃色假色。（a）方形結構內的Y形結構（8×9×4個液滴），平均特征寬度為180μm。（比例尺=200μm）。（b）方形結構內的HEK-293細胞的十字形圖案（10×12×5個液滴）。（比例尺=250μm）。（c）（b）中圖案化HEK-293細胞的高倍放大圖像。（比例尺=100μm）。（d）立方體細胞結構的3D模型，在x-z平面的對角線上具有兩個HEK群體（HEK 1，黃色；和 HEK 2，青色）之間的界面。（e，f）根據（d）中的模型打印的細胞構建體（21×24×7個液滴）在固定垂直位置（分別為45和192μm）的部分橫截面，顯示了兩個HEK群體。（比例尺=250μm）。（g-j）層狀結構的側面圖像，包括相轉移前后的CellTracker™染色的HEK-293細胞。下部DR染色的HEK-293細胞層（黃色）為3滴厚，而上部RC染色的HEK-293細胞層（藍色）為4滴厚（g,h）或3滴厚（i ,j）。記錄圖像：（g）在第0天，在油中，打印后立即；（h）轉移到培養基后立即；（i）在培養基培養的第3天；（j）在培養的第5天，在培養基中。（比例尺=250μm）。
▲ 圖3 含有HEK-293T細胞的打印結構的相轉移和培養。（a）打印結構的凝膠封裝和相轉移。通過在4°C下靜置20到25分鐘使打印的細胞構建體凝膠化，并通過在室溫下用硅油AR20洗滌去除油中的脂質。然后將構建體涂上一層薄薄的無細胞生物墨水，通過在4°C下靜置20到25分鐘使其凝膠化。然后將凝膠化的構建體轉移到油培養基兩相系統的上相中。構建體通過油落入培養基中。（b）在油下打印后立即打印為長方體結構（7×8×4液滴）的活/死染色HEK-293T細胞的z-stack 3D重建圖像。打印液滴的平均密度為2.9×107個細胞/mL，存活率為96%。（比例尺=200μm）。（c）凝膠封裝并轉移到培養基后活/死染色打印HEK-293T細胞的z-stack 3D重建圖像。（比例尺=200μm）。（d）圖表顯示了在轉移到培養基后第0天五個打印構建體的HEK-293T細胞活力（包括平均值的標準誤差）。通過使用自動對象計數來確定生存力，其值使用未經修改或相對于平均細胞大小解析。（e）第7天在培養基中的構建體上進行的免疫細胞化學z-stack 3D重建圖像：細胞核（DAPI，藍色）；活細胞的細胞質（CAM，綠色）和；有絲分裂標記（磷酸組蛋白H3 ICC、PH3、白色）。（比例尺=200μm）。
由于構建體是在油中組裝的，因此液滴以六邊形陣列堆積。相比之下，當在空氣中打印液滴時，它們會變平，并且在水平面上的打印分辨率會降低。構建體可以用高濃度的細胞打印，而不會出現明顯的聚結或結構保真度的損失，這歸因于Fmoc-二肽的摻入和生物墨水中胎牛血清（FBS）的省略。為了在凝膠封裝和相轉移過程中穩定構建體，生物墨水補充有瓊脂糖（1.0至1.2w/v%），使打印的圖案保留在固化的水凝膠中。Fmoc-二肽的存在還通過增加打印液滴之間的界面粘附力來幫助圖案保留，從而產生更具凝聚力的結構。

參考文獻：

[1] Graham A   ,   Olof S N ,   Burke M J , et al. High-Resolution Patterned Cellular Constructs by Droplet-Based 3D Printing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1).

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