??cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)，即First Strand cDNA Synthesis Kit(RNase H minus)是一種采用了經過改造和優化的M-MuLV反轉錄酶(RNase?H-)，用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎上反轉錄產生
cDNA第一鏈的試劑盒。本試劑盒包含了進行cDNA第一鏈合成所需的各種試劑。
采用本試劑盒可以合成長達13kb的cDNA第一鏈。在采用M-MuLV反轉錄酶(RNase?H-)的情況下，由于缺失了RNase?H，RNA和DNA雙鏈復合物中的RNA不會被降解，這樣反轉錄出來的cDNA的長度就會更長，并且產量更高。
試劑盒中提供了RNase?Inhibitor，確保在反轉錄過程中的RNA不會被RNA酶所降解并取得較好的反轉錄效果。
試劑盒還提供了Oligo(dT)18和random?hexamer這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉錄，后者進行反轉錄時不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特異性引物進行cDNA第一鏈的合成。
試劑盒中提供的Control Primer為17聚，即引物的長度為17個堿基。試劑盒中提供的Control RNA為帶有3’poly(A)的
1.1kb RNA。
使用本試劑盒合成的第一鏈，可以直接用于后續的常規PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。
本試劑盒用于體積為20微升的cDNA第一鏈合成反應時足夠進行10個cDNA第一鏈樣品的合成。
包裝清單：
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| D7166-1 | M-MuLV反轉錄酶(RNase H-)(200U/μl) | 2000U |
| D7166-2 | Reaction Buffer(5X) | 50μl |
| D7166-3 | RNase Inhibitor(20U/μl) | 10μl |
| D7166-4 | dNTP Mix(10mM each) | 20μl |
| D7166-5 | Oligo(dT)18?Primer(0.5μg/μl) | 10μl |
| D7166-6 | Random Hexamer Primer(0.2μg/μl) | 10μl |
| D7166-7 | Control RNA(20ng/μl) | 6μl |
| D7166-8 | Control Primer(5pmol/μl) | 6μl |
| D7166-9 | DEPC-treated Water | 0.2ml |
| － | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：?
對于GC含量比較高的RNA的反轉錄，試劑盒的使用說明中給予了特別說明，請予以關注。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。?
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使用說明：
1. cDNA第一條鏈的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 參考如下表格設置反轉錄反應：
| 模板(后面4種任選一種) | Total RNA | 0.01-5μg |
| 或Poly(A) RNA/mRNA | 1-500ng | |
| 或Specific RNA | 0.01pg-500ng | |
| 或Control RNA | 2μl | |
| 引物(后面3種任選一種) | Oligo(dT)18?Primer (0.5μg/μl) | 1μl |
| Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) | 1μl | |
| Gene specific primer | 15-25pmol | |
| DEPC-treated Water | － | To 12μl* |
| 70℃孵育5分鐘，隨后立即放置到冰浴冷卻，4℃微離心，隨后加入下述試劑** | ||
| Reaction Buffer (5X) | － | 4μl |
| RNase Inhibitor (20U/μl) | － | 1μl |
| dNTP Mix (10 mM each) | － | 2μl |
| MuLV反轉錄酶(RNase H-) | － | 1μl |
| 總體積 | ? | 20μl |
*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。
70℃孵育5分鐘并且隨后冰浴冷卻，這樣可以使RNA模板的二級結構充分打開。
b. 輕輕混勻(可以用Vortex在最低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后離心沉淀液體。
c.?如果使用Oligo(dT)18作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用random hexamer(隨機六聚體)作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。
注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉錄反應，可以設置為45℃孵育60分鐘。
d. 70℃孵育10分鐘以失活 M-MuLV反轉錄酶(RNase H-)并終止反轉錄反應。
說明：對于長片斷的cDNA不推薦采用加熱的方法失活M-MuLV反轉錄酶(RNase H-)，這種操作可能會導致部分長片斷DNA被剪切。
e. 反轉錄產物可以直接用于后續的PCR等反應，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續PCR反應時，如果PCR的反應體系為50微升，則推薦使用2微升反轉錄產物。
2. 其他用途請自行參考M-MuLV反轉錄酶(RNase H-)的相關文獻資料進行。
常見問題：
1. RNA反轉錄產物電泳觀察不到。
反轉錄產物由于是從模板反轉錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉錄的量通常還要少于模板量，因此通常RNA的反轉錄產物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉錄產物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設計欠佳，當然也有可能是反轉錄產物質量欠佳。如果內參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉錄產物質量欠佳。
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