作者：Julia Karow
???? Baylor醫學院人類基因組測序中心（HGSC）經過對Life Technologies的Ion ProtonTM平臺的廣泛測試，迄今為止已經完成了360多次運行，并且將其在外顯子組測序中的表現與Illumina技術進行了比較。另外，它還針對Ion PGMTM開發了多個應用，PGMTM目前已進入數據生產線。
????本月早期在冷泉港實驗室召開的個人基因組和醫學基因組學會議上，HGSC的運營主管Donna Muzny詳細介紹了該中心使用這兩個平臺的體驗。
????Baylor HGSC目前擁有16臺Illumina HiSeq、兩臺Illumina MiSeq、四臺Ion ProtonTM、四臺Ion PGMTM、三臺羅氏/454儀器，一臺PacBio RS以及若干臺Sanger測序儀。
????ProtonTM的測試版于今年4月在該中心開始使用，并在9月升級到了商業版。截至11月中旬，該中心已在ProtonTM上完成了360多次運行。最初用于測試一系列標準微生物、哺乳動物的BAC，以及來自人類HapMap樣品和靈長類動物的文庫。
????上個月，該中心開始利用改進型磁珠在ProtonTM上測試了200 bp的讀取，這些磁珠預計在12月份正式發售。它們的結合性能更佳，因此支持更長的文庫并連接更多的模板。Muzny在報告中稱，它們還能改善數據質量，使比對后的Q20堿基增加三倍。因此，HGSC目前每次運行實現了9-10 Gb的比對數據，包括最近一次11.5 Gb的運行。她談道，該平臺如今能在22小時內產生比對數據，運行時間僅為4小時。
????最近，研究人員還評估了Proton在外顯子組測序上的表現，并就同一個樣品的結果與Illumina的HiSeq平臺進行了比較。
????在比較中，他們對一名之前測序過的患有腓骨肌萎縮癥個體的外顯子組進行了測序，分別采用的是Baylor基于NimbleGen的VCRome 2.1外顯子組捕獲設計、ProtonTM PI芯片和200 bp讀取。運行產生了8.7 Gb比對數據，平均覆蓋度為91x，且92%目標堿基的覆蓋度至少為20x。
????兩個平臺產生的結果大幅重疊：94%的高質量單核苷酸變異在兩個數據集中都檢出，但實驗室未檢測插入缺失的重疊。重要的是，ProtonTM也同樣鑒定出了兩個致病突變——正是Baylor科學家之前發表在《新英格蘭醫學雜志》上的。
????Muzny表示，該中心2013年的目標是在ProtonTM平臺上產生臨床級別的外顯子組。
????Baylor HGSC還擁有四臺Ion PGMTM。他們在2011年1月開始運行該平臺，并在大約一年前轉移到生產模式，主要運行在擴增子和區域捕獲測序應用。
????該中心目前利用318芯片和300 bp讀取，在PGMTM上每次運行能產生超過1 Gb的數據。應用范圍包括擴增子測序、線粒體基因組測序、區域捕獲測序、外顯子組測序，以及16S宏基因組測序和mate-pair文庫測序，用于結構變異檢測。
????與此同時，Baylor還利用Ion TorrentTM標準的文庫操作和貝克曼庫爾特的Biomek FXp雙臂機器人將PGMTM的文庫構建自動化，，并開發出Ion TorrentTM特異的單核苷酸變異檢出程序，命名為VarIONt。
????PGMTM上擴增子測序的應用之一是驗證其他測序平臺所發現的變異。Muzny稱，僅在上兩個月，他們就在PGMTM上驗證了4000多個來自癌癥項目的變異位點。
????而擴增子測序的另一個應用是疾病發現。例如，該中心已篩查了約50個人的一個大基因，它與某種形式的心肌病有關，在9名受試者中發現了10個有害突變。
????此外，HGSC還在PGMTM上嘗試了線粒體基因組測序分析，目前Baylor的全基因組實驗室是在Illumina平臺上運行的。該分析利用長距離PCR，當變異存在于至少10%的讀取時，它可以檢測線粒體異質性。
????為了驗證該分析，Baylor將PGMTM上產生的數據與Illumina MiSeq的數據進行了比較，兩者均采用 ProtonTM比較時的腓骨肌萎縮癥樣本。長距離PCR反應需要10 ng起始DNA，而文庫構建需要1 μg PCR產物。Muzny表示，PGM和MiSeq都發現了31個相同的線粒體變異，但PGMTM還發現了一個MiSeq漏掉的真正變異，而MiSeq的數據還包含三個假陽性變異。在其他五個之前分析過的患者樣本中，PGMTM也發現了所有的已知疾病突變。
????最近，Baylor的研究小組正在為PGMTM開發區域捕獲設計以及外顯子組測序。其中的優化步驟包括將文庫構建的DNA起始量降低到1 μg，以及文庫制備過程的其他改變。
????到目前位置，Baylor已經設計出多個區域捕獲panel，大小在0.1-7 Mb，適用于視網膜疾病、血栓形成和部分X染色體。Baylor還在PGMTM上評估了VCRome 2.1全外顯子組設計。
????就PGMTM的運行成本而言，Muzny認為該平臺目前比羅氏454“便宜多了”，與Illumina MiSeq“不相上下”。