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人AAVS1的TALENs質粒構建

摘要： 設計針對AAVS1（位于人類PPP1R12C基因的第一內含子內） 的TALENS質粒。通過固相連接等分子生物學手段，將TALENs預制模塊連接到表達載體。測序結果顯示，上下游TALENs質粒對構建成功，分別識別的基因組序列為：CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT。該TALENs質粒對配合Donor質粒，可以高效地將外源基因定點插入到AAVS1位點?？捎糜诤Y選定點整合穩定細胞株。
關鍵詞：AAVS1，TALENs, 定點整合穩定細胞株

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一、?實驗原理
TALE 構建技術（Transcription activator–like effector engineering technology）是基于植物病原體黃單胞菌( Xanthomonas) 分泌的一種轉錄激活子樣效應因子( transcription activator–like effector，TALE) 可以識別DNA序列的原理而設計和構建靶向特異基因的TALE蛋白的技術。TALE 蛋白是由N 端分泌信號、中央DNA結合域、核定位信號和C端激活域構成。TALE蛋白的DNA結合域是由可以識別單個核苷酸堿基的氨基酸序列模塊串聯而成的， 氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系。利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化組合蛋白，從而達到識別內源性基因的目的。
TALEN 技術是將TALE 蛋白中的DNA結合域與FokI 核酸內切酶的切割域融合，設計和構建能在特定基因位點產生雙鏈斷裂的的技術。雙鏈斷裂可以極大的提高斷裂位點周圍的基因修復活性，利用易錯修復(非同源末端聯結)或者同源重組修復的方式實現特異位點DNA的改造，例如定點基因敲除 (Knock-out) 、基因敲入 (Knock-in) 或點突變修飾等等。研究結果顯示，人工構建的TALENs能夠對動植物細胞的基因組進行高度特異的和高效的修飾。TALENs的活性和DNA序列識別的特異性在酵母、植物和哺乳動物包括人類等多種細胞中已經相繼得到驗證。

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二、?實驗目的
構建識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列的TALENs切割質粒對。

人AAVS1在基因組中的序列信息：
CCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCCGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAG

左側識別序列長度: 17(C-CCCT-CCAC-CCCA-CAG-T)
右側識別序列長度: 17(T-TTCT-GTCA-CCAA-TCC-T)
兩個識別位點間隔15個堿基

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三、?實驗方法
以PCR的方法獲得起始片段（識別1位堿基），用Bsa I酶切后做膠回收；從克隆庫里面挑選含合適的識別位點的質粒以酶切的方法獲得3~4個延伸片段（每個延伸片段一般識別4位堿基）；從克隆庫里面挑選含合適的識別位點的質粒以酶切的方法獲終止片段（一般識別2~3位堿基）。起始片段通過正向引物上標記的Biotin固定在磁珠上面，通過快速連接酶依次連接上延伸片段和終止片段，最后通過起始片段上的Bbs I酶切位點把全長片段從磁珠上面酶切下來。TALENs表達載體有4種，在多克隆位點下游分別還有一個分別識別A、T、G或C的序列，其中識別T序列的載體圖譜如下。酶切后和以上獲得的插入片段連接，得到識別特異位點的Talens質粒。

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1.?起始片段的制備：
分別以預先構建的識別A、T、G或C序列的質粒為模板， 用TALENs-F1： Biotin –TCTAGAGAAGACAAGAACCTGACC和TALENs-R1?? GGATCCGGTCTCTTAAGGCCGTGG進行PCR擴增。目的片段PCR擴增成功后，進行瓊脂糖凝電泳檢測，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
2.?延伸片段和終止片段制備：
從克隆庫里面挑選含合適的識別位點的質粒用限制性內切酶進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10x反應Buffer 5μl，限制性內切酶各1μl，用水補足50μl，于37℃水浴鍋孵育2小時以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
3.?全長片段的制備：
起始片段通過正向引物上標記的Biotin固定在磁珠上面，通過快速連接酶依次連接上延伸片段和終止片段，最后通過起始片段上的Bbs I酶切位點把全長片段從磁珠上面酶切下來。
4.?表達載體的線性化：
Talens表達載體有4種，在多克隆位點下游分別還有一個分別識別A、T、G或C的序列。用限制性內切酶分別對4種載體行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10x反應Buffer 5μl，限制性酶切酶各1μl，用水補足50μl，于37℃水浴鍋孵育2小時以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝電泳檢測酶切效果， 并把目的載體條帶從瓊脂糖凝電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?全長片段和線性化載體的連接：
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?????????????????????于室溫25℃ 連接15min，10μl反應液轉化到100μl感受態細胞中。

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6.?感受態細胞的制備和轉化：
DH5α感受態細胞的制備和轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》。
7.?菌落PCR鑒定陽性轉化子：
挑取平板上長出的轉化子重懸于10μl LB培養液中，取1μl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

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8.?陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送公司進行測序驗證。軟件比對測序結果并分析。
9.?質粒小提：
經測序驗證正確的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、?實驗結果
1.?起始片段的制備：
分別以預先構建的識別A、T、G或C序列的質粒為模板，用TALENs-F1： Biotin –TCTAGAGAAGACAAGAACCTGACC（引物說明：Biotin標記的正向引物，含Bbs I酶切位點）和TALENs-R1：GGATCCGGTCTCTTAAGGCCGTGG（反向引物含Bsa I-HF酶切位點）進行PCR擴增。預期PCR產物大小為137 bp，電泳結果如下：

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1.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
2.?PCR產物大?。?37bp

2.?延伸片段和終止片段制備：
從克隆庫里面挑選含合適的識別位點的質粒用限制性內切酶進行酶切，酶切產物進行進行瓊脂糖凝電泳檢測酶切效果。酶切圖譜如下圖所示，其中大片段為載體片段，小片段為延伸片段或終止片段。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收延伸片段和終止片段。

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3.?菌落PCR鑒定陽性克隆：
用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物T-SEQF：GCAGCTGCTGAAGATCGC位于克隆位點BsmB I的上游，用來菌落PCR鑒定陽性克隆和陽性克隆測序；反向引物T-SEQR：TCATTCGTTAACGCAGCCAAC位于克隆位點BsmB I的下游，用來菌落PCR鑒定陽性克隆和陽性克隆測序。陽性克隆得到約1.8kb的片段，空載體對照得到約200bp的片斷。
pTALEN-AAVS1-F菌落PCR鑒定圖：
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1.?陰性對照（空載體）
2.?陽性對照（其他陽性Talens質粒）
3.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11. 挑取的8個轉化子，其中2號、5號、6號、8號為陽性克隆，其他為空載體或者插入的片段不是全長序列。由于插入的片段是以100bp左右為單位的重復片段，所以PCR過程容易出現彌散條帶，但不影響對陽性克隆的判斷。接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。經驗證序列無誤的，抽提質粒。

pTALEN-AAVS1-R菌落PCR鑒定圖：
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1.?陰性對照（空載體）
2.?陽性對照（其他陽性Talens質粒）
3.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.? 挑取的8個轉化子，其中1號、2號5號和7號為陽性克隆，其他為空載體或者插入的片段不是全長序列。由于插入的片段是以100bp左右為單位的重復片段，所以PCR過程容易出現彌散條帶，但不影響對陽性克隆的判斷。接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。經驗證序列無誤的，抽提質粒。

4.?陽性克隆測序結果分析:
pTALEN-AAVS1-F全長CDS，其中紅色字體標記的是插入片段。藍色熒光標記的分別是上下游鑒定引物T-SEQF和T-SEQR序列，綠色熒光標記的是被BsmB I酶切開的序列。
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGCACTTGAGGCGCTGCTGACTGTGGCGGGTGAGCTTAGGGGGCCTCCGCTCCAGCTCGACACCGGGCAGCTGCTGAAGATCGCGAAGAGAGGGGGAGTAACAGCGGTAGAGGCAGTGCACGCCTGGCGCAATGCGCTCACCGGGGCCCCCTTGAACCTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCACATGACGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCAAACGGAGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCACATGACGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGAACATTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAACAACAACGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACACCCGAACAGGTGGTCGCCATTGCTTCTAATGGGGGAGGACGGCCAGCCTTGGAGTCCATCGTAGCCCAATTGTCCAGGCCCGATCCCGCGTTGGCTGCGTTAACGAATGACCATCTGGTGGCGTTGGCATGTCTTGGTGGACGACCCGCGCTCGATGCAGTCAAAAAGGGTCTGCCTCATGCTCCCGCATTGATCAAAAGAACCAACCGGCGGATTCCCGAGAGAACTTCCCATCGAGTCGCGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAA

pTALEN-AAVS1-R全長CDS，其中紅色字體標記的是插入片段。
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGCACTTGAGGCGCTGCTGACTGTGGCGGGTGAGCTTAGGGGGCCTCCGCTCCAGCTCGACACCGGGCAGCTGCTGAAGATCGCGAAGAGAGGGGGAGTAACAGCGGTAGAGGCAGTGCACGCCTGGCGCAATGCGCTCACCGGGGCCCCCTTGAACCTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCAAACGGAGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCAAACGGAGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAATAATAACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACACCCGAACAGGTGGTCGCCATTGCTTCTAATGGGGGAGGACGGCCAGCCTTGGAGTCCATCGTAGCCCAATTGTCCAGGCCCGATCCCGCGTTGGCTGCGTTAACGAATGACCATCTGGTGGCGTTGGCATGTCTTGGTGGACGACCCGCGCTCGATGCAGTCAAAAAGGGTCTGCCTCATGCTCCCGCATTGATCAAAAGAACCAACCGGCGGATTCCCGAGAGAACTTCCCATCGAGTCGCGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAA

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五、?參考文獻
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