服務介紹： 免疫熒光三重標記即利用抗原抗體特異性結合原理，在同一張切片上3個抗原進行同時標記，從而實現定位，定性，半定量的分析 實驗流程： 1石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min-蒸餾水洗。 2 抗原修復：組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液（PH6.0）的修復盒中于高壓鍋內進行抗原修復。噴氣計時2min30s，自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定） 3 畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內源性的過氧化物酶，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min 4 血清封閉: 切片稍甩干，滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉） 5 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發） 6 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。 7 加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加CY3-TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min 8 高壓修復：組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液（PH6.0）的修復盒中于高壓鍋內進行抗原修復，噴氣計時2min30s，自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。 9 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發） 10 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。 11 加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min 12 高壓修復：組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液（PH6.0）的修復盒中于高壓鍋內進行抗原修復，噴氣計時2min30s，自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片 13 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發） 14 加CY5標記的熒光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的CY5標記熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。 15 DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。 16 淬滅組織自發熒光：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。 17 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 18 切片置于掃描儀下采集圖像:DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光.。CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712,，CY5原本為正紅色，為了與CY3區分開，我們設定為粉色光。