?Western Blotting實驗技術對外服務（傳統方法）

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免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

操作流程：

1樣品準備

1）分別取大約200mg組織加入液氮碾磨成粉末狀，按每200mg組織加900μl上樣Buffer(無溴酚藍)和100ul 10mg/ml PMSF，混勻，玻璃勻漿器冰點勻漿

2）4℃，12000rpm離心10min

3）取上清夜-70℃凍存24hr

5）4℃12000rpm再次離心10min，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min，后于-20℃保存待用。

2定蛋白及計算電泳上樣量

根據總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為40ug

3電泳

1）安裝好電泳裝置

2）根據不同的指標配制相應濃度的分離膠，灌膠約3/5體積，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇)

3）30min后，待凝后傾去封液

4）配5%的濃縮膠，灌膠至距平板頂部2mm處，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去離子水清洗加樣孔，用濾紙吸干

5）上樣：各樣品取50ug上樣，marker取10μl上樣(上樣前需按說明書進行預處理)

6）緩慢加入內、外槽緩沖液，接通電源，90v電泳至指示劑進入分離膠后，調電壓至150V繼續電泳

7）當指示劑距平板底端1cm處時停止電泳

4 轉膜及檢測

1）準備2個Φ12cm的平面皿，一個裝去離子水浸泡NC膜20min，另一裝轉移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min

2）取下膠，切除濃縮膠部分后，將分離膠浸入轉移緩沖液中約5min

3）按順序安裝好轉膜裝置（黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板）

4）完全排除氣泡，4℃，100mA轉膜2hr。

5）傾去轉膜緩沖液，拆除轉膜裝置，將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min，用去離子水清洗至能看到條帶，后用鉛筆標出marker位置，再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右

6）將膜轉移至另一容器中，用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過夜

7）將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗

8）37℃搖床孵育約2hr

9）PBST洗滌4次，每次5min

10）將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗，37℃搖床孵育約30min

11）PBST洗滌4次，每次5min

12）將膜轉移至盡可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室溫孵育30min

13）取出NC膜，用蒸餾水漂洗后晾干

14）掃描及分析

服務要求：

• 樣本要求：組織樣品，每份樣本約250-500mg,新鮮或正確保存的組織。細胞樣本：每份樣本：1*10 6－1*10 7細胞數。
• 客戶提供有效的一抗，（國產抗體一般不接納） 一抗自備或代購。
• 客戶提供欲檢測目的蛋白的詳細背景資料。以及提供樣本的種屬，類型。

結果提供：

• 目的蛋白實驗圖片。
• 灰度分析結果。（免費分析）
• 內參結果。（免費跑膠）
• 詳細的實驗步驟。
• 免費提供蛋白樣本保存液。

完成時間：

接受樣本后，1月以內。

注意事項：

1、客戶要確保模型建造的成功性。

2、客戶要確?？贵w的有效性。

3、如要加快的客戶可以和我們聯系溝通。

4、收費標準：以每張膜8個樣本收費，不足8個樣本的按8個樣本收費）

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