產品簡介

2×Universal qPCR Fluore Green Master Mix (No ROX adjustment)是2×實時定量PCR擴增的預溶液，高靈敏度、高特異性，顏色為藍色，具有加樣示蹤的作用。核心組分Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增；同時添加了提升PCR反應擴增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴增的促進因子，可以在較為寬泛的定量區域內獲得良好線性關系。

本產品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需根據不同儀器調整ROX。

產品信息

儲存條件

冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。

本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。

注意事項

1. 推薦使用Arcegen一鏈cDNA合成反轉錄預混液（Cat#N132061），有效去除RNA樣品的殘留基因。

2. 解凍后Master Mix可能出現絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

4. 本產品僅用于科研。

使用說明

1. 反應體系

【注】使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

1) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。

2) 模板濃度：如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。

3) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的Ct值在20-30個循環為好。     

4) 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

5) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

標準程序                                                      

快速程序

【注】快速程序適用于絕大多數基因，個別復雜二級結構基因可嘗試標準程序。

1) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。

2) 熒光信號采集（★）：請勿忘記打開熒光信號采集，按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

3) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。

2. 結果分析

定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。

1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。

Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確。

Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗。

Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性。

Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲線：

熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。

熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。

如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。

如果是非特異性擴增，請提高退火溫度，或者重新設計更高特異性的引物。

3. 引物設計指南

1) 推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。

2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。

3) 引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

4) 引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。

5) 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。

6) 設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。

4. 適用機型

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler;

Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.