產品簡介

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit）是用Alexa Fluor 647標記了的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發生，可用流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。

檢測原理：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin V（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合?？赏ㄟ^細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯合使用時，PI則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Alexa Fluor 647和PI結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

本試劑盒需要使用流式細胞儀進行檢測。

產品規格

組分信息

儲存條件

冰袋（wet ice）運輸。-20℃避光保存，避免反復凍融，一年有效期。如果需要在短時間內多次重復使用，可以在4℃避光保存，半年有效期。

注意事項

1. 由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。
2. 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-Alexa Fluor 647的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。
3. 如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。血小板含有PS，可與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并以200 g離心洗去血小板。
4. 試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體集中至管底，避免開蓋時液體灑落引起損失。
5. Annexin V-Alexa Fluor 647和PI是光敏物質，操作時請注意避光。
6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
7. 本產品僅用于科研。

使用說明

一、樣品染色

1. 懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞。貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。
2. 用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g，4℃離心5 min。
3. 加入1×Binding Buffer重懸細胞，調節其濃度為1-5×10⁶細胞/mL。
4. 取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647，輕輕混勻后于室溫避光孵育5min。
5. 加入10 μL PI（20 µg/mL）。
6. 加入400 μL PBS Buffer，混勻，樣品在1小時內檢測。

【注意】為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

二、流式細胞儀分析

Annexin V-Alexa Fluor 647最大激發波長為651 nm，最大發射波長為667 nm；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），Annexin V-Alexa Fluor 647為橫坐標，PI為縱坐標。每個樣采集10,000 events。