?脂質組學檢測分析方案
人血清UHPLC-QTOF-MS脂質組學檢測分析方案
一、項目簡介
1.1 脂質組學介紹
脂質是自然界中存在的一大類極易溶解于有機溶劑、在化學成分及結構上非均一的化合物，主要包括脂肪酸及其天然發生的衍生物(如酯或胺)，以及與其生物合成和功能相關的化合物。
脂質大體分為八大類：1.脂肪酸類（fatty acids）2.甘油脂類（glycerolipids）3.甘油磷脂類（glycerophospholipids）4.鞘脂類（sphingolipids）5.固醇脂類（sterol lipids）6.孕烯醇酮脂類（prenol lipids）7.糖脂類（saccharolipids）8.多聚乙烯類（polyketides）。
脂質組學（lipidomics）是對生物體、組織或細胞中的脂質以及與其相互作用的分子進行全面系統的分析、鑒定，了解脂質的結構和功能，進而揭示脂質代謝與細胞、器官乃至機體的生理、病理過程之間的關系的一門學科。目前脂質組學已經被廣泛運用于藥物研發，分子生理學，分子病理學，功能基因組學，營養學以及環境與健康等重要領域。
脂質組學研究的技術主要包括脂質的提取、分離、分析鑒定以及相應的生物信息學技術。生物質譜技術是目前脂質組學研究的核心工具。脂質組學相關的公共資源：LIPIDMAPS、Lipid Bank、Cyber Lipids和LIPIDAT。
1.2 樣本信息
人血清樣品，分對照組（C）、模型組I（M1）和模型組II（M2），每組取25個平行樣品，進行UHPLC-QTOF-MS脂質組學檢測分析，并對得到數據進行進一步生物信息學分析。
樣品詳情：共計75例樣品。

1.3 對比策略
針對脂質組學數據分別進行如下對比，并對得到數據進行進一步的生物信息學分析：
進行M1組 vs C組，M2組 vs C組，M2組 vs M1組共計3次對比分析。
1.4分析內容
基礎數據分析包括：數據預處理，定性及定量分析，PCA 分析（principal component analysis），正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），差異脂質化合物篩選。
個性化數據分析包括：脂質氣泡圖
1.5 檢測平臺
檢測平臺：UHPLC-QTOF-MS, AB Triple TOF 6600, AB Sciex

二、數據分析方案
基礎數據分析
2.1 數據預處理
樣本在高分辨質譜上分別做了正負離子兩次掃描，基于IDA功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行對應的二級質譜數據采集，得到原始數據文件。通過質控樣品的原始總離子流(TIC)色譜圖，初步觀察儀器的保留時間重現性，所測得的峰數量，以及初步判斷脂質大類檢測情況。數據的質控采用QC樣本RSD<30%進行篩選，features得率>80%，則說明系統穩定性良好。峰查詢，峰對齊等預處理采用XCMS軟件（版本號：1.41.0）進行。

圖1. 所有質控樣本正離子（ESI+）模式重疊總離子流（TIC）色譜圖


圖2. 所有質控樣本負離子（ESI-）模式重疊總離子流（TIC）色譜圖

2.2 定性及定量分析
物質鑒定的數據處理及匹配：使用本實驗室基于XCMS開發的xcms4dda和xcms4lipid程序及自建庫進行處理。首先對二級數據進行篩選，也就是篩選出來那些鑒定出來的peak。篩選原則為forward和reverse只要其中有一個鑒定出來就保留該peak。其次對一級和二級數據的peak進行匹配，也就是尋找一級數據中的peak在二級數據中對應的peak。
最終的鑒定結果如下表所示：

圖3. 樣本的定性定量結果（部分）

2.3 PCA分析（principal component analysis）
數據經過標準化處理后，對樣本進行主成分分析，該分析能從總體上反應各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。軟件采用瑞典Umetrics公司的SIMCA14.1，數據采用UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）處理[1]，以獲得更加可靠且更加直觀的結果。軟件進行自動化模型擬合分析，獲得最可靠數學模型的主成分數目。例圖如下所示：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖4.?Scores plot of total?PCA



圖5. Scores plot of PCA?for two groups

2.4正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）
為了消除與分類不相關的噪音信息，同時也為了獲得導致兩組之間顯著差異的相關代謝物信息，我們采用正交偏最小二乘方判別分析（OPLS-DA）過濾與模型分類不相關信號即正交信號，獲得OPLS-DA模型。對模型的質量用交叉驗證法進行檢驗，并用交叉驗證后得到的R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預測度)對模型有效性進行評判。在此之后，通過排列實驗對模型有效性做進一步的檢驗。
例圖如下所示：

圖6. Scores plot of OPLS-DA（2D） ?????????????圖7. Loading plot of OPLS-DA^[2]?

[2] 載荷圖（loading plot）的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大小（cosα），縱坐標代表每個物質在第二主成分上的載荷大?。╟osβ）。

圖8. Permutation test of OPLS-DA^[3]??????????????????圖9. S-plot of OPLS-DA^?[4]?
[3] 置換檢驗的橫坐標代表隨機分組的Y與原始分組Y的相關性，縱坐標代表R2和Q2的得分。
[4] S-plot的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大?。╟osα），縱坐標代表每個物質和第一主成分相關系數（可靠性）的大小。

2.5差異脂質化合物篩選
?通過OPLS-DA分析過濾掉了不相關的正交信號，因而獲得的差異性代謝物更加可靠。本項目采用 OPLS-DA 模型第一主成分的VIP（Variable Importance in the Projection）值（閾值>1），并結合學生氏t 檢驗(t-test)的p 值（閾值0.05）來尋找差異性表達代謝物。