?克隆形成實驗

摘要：在A549細胞中過表達human Oct-4基因，通過對Oct-4基因過表達細胞組、空細胞組與陰性對照組克隆形成數量的統計學分析，研究Oct-4對A549細胞群體依賴性和增殖能力的影響。實驗結果顯示Oct-4基因的表達促進A549細胞的克隆形成能力。為進一步深入研究Oct-4基因的功能提供實驗數據。
關鍵詞：Oct-4，克隆形成，A549

一、?實驗原理
單個細胞在體外增殖6代以上（時間約1周以上），其后代所形成的細胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數， 但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖并形成克隆。只有同時具有貼壁和增殖活力的細胞才會形成克隆?？寺⌒纬陕史从臣毎莫毩⑸婺芰Φ膹娙?，用于評價細胞群體依賴性和增殖能力。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強； 二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強?？寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在培養皿中，持續一周以上，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。

二、?實驗目的
使用Oct-4-EGFP質粒瞬時轉染A549細胞。通過觀察Oct-4過表達的A549細胞的克隆形成率研究Oct-4基因對細胞增殖的影響。

三、?實驗步驟
實驗共分以下5個主要步驟：
1.?質粒轉染細胞：
準備A549細胞，轉染前一天按照60-70%密度鋪在6孔板中。16h后，按照轉染試劑說明書轉染細胞（4μg質粒，10μl和元生物轉染試劑）。
2.?制備單細胞混懸液：
轉染24h后，將細胞消化，制成細胞懸液，血球計數板計數。
3.?細胞均勻接種于細胞培養平板：
鋪板，6孔板每孔鋪200 -1000個細胞，每組細胞各鋪3個復孔。
4.?細胞培養2到3周：
每隔3天換一次新鮮培養基。
5.?觀察克隆，染色，計算克隆形成率：
10~14天后，染色液染色。數碼相機拍照或者掃描儀掃描，計算克隆形成率。

四、?實驗結果

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???????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. 過表達Oct-4對A549細胞克隆形成的影響
?????從左開始依次為A549空細胞組，對照組（過表達EGFP），實驗組（過表達Oct-4-EGFP），每組實驗均重復3次

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??????????????????????????????????????????????????????????圖2. 過表達Oct-4對A549細胞克隆形成影響的統計分析
????????????????????????????????????????????????????????????????????????????**表示p<0.01;***表示p<0.001

結論：從實驗結果以及克隆數的統計分析可以發現，A549細胞在過表達Oct-4-EGFP后，克隆形成能力均高于空細胞組（p<0.01）以及對照組（p<0.001）。

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