穩(wěn)定細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn)
產(chǎn)品名稱(chēng)： 穩(wěn)定細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn)
英文名稱(chēng)： Stable cell lines construction
產(chǎn)品編號(hào)：
產(chǎn)品價(jià)格： 10000
產(chǎn)品產(chǎn)地： null
品牌商標(biāo)： null
更新時(shí)間： null
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穩(wěn)定細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn)
摘要： 本實(shí)驗(yàn)使用過(guò)表達(dá)human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa細(xì)胞。該病毒的表達(dá)框?yàn)閜Lenti-CMV-Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Oct-4-EGFP基因的表達(dá)， 同時(shí)由PGK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)puromycin抗性基因的表達(dá)。在感染HeLa細(xì)胞72h后，通過(guò)加入并維持2μg/ml的puromycin殺死未被有效感染的細(xì)胞。從而在puromycin藥物的維持下最終獲得Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達(dá)的混合穩(wěn)定株。
關(guān)鍵詞：Oct-4-EGFP，穩(wěn)定細(xì)胞株， HeLa，慢病毒
一、?實(shí)驗(yàn)原理
外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬時(shí)表達(dá)，一類(lèi)是穩(wěn)定表達(dá)（永久表達(dá)） 。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長(zhǎng)期表達(dá)目的基因。建立穩(wěn)定細(xì)胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。最常用的抗性標(biāo)記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin進(jìn)行選擇性篩選。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過(guò)外源基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選， 最終獲得從單一細(xì)胞擴(kuò)增起來(lái)的穩(wěn)定細(xì)胞株， 該方法陽(yáng)性率低，周期長(zhǎng)，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒感染細(xì)胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組以后才能表達(dá)。利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來(lái)篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高效率的穩(wěn)定細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞或者可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，用于蛋白的擴(kuò)增和富集；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。
二、?實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
通過(guò)慢病毒感染配合藥物篩選的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)Oct-4-EGFP的HeLa穩(wěn)定細(xì)胞株。
三、?實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)共分以下3個(gè)主要步驟：
1.?細(xì)胞鋪板：
將HeLa細(xì)胞按30%的融合度接種到24孔板：
1)?HeLa細(xì)胞配成1×105 cells/ml細(xì)胞懸液，待鋪板。
2)?每孔鋪500μl，即5×104 cells/well，鋪1塊24孔板。
2.?感染慢病毒：
12~20h后感染慢病毒：
1)?根據(jù)公式計(jì)算病毒用量： （細(xì)胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μl）。
2)?本實(shí)驗(yàn)中MOI取10，吸去與加入病毒體積相同培養(yǎng)基。
3)?每孔加2.5μl的polybrene (1mg/ml)，使polybrene終濃度達(dá)到5μg/ml。
4)?24h后換液，棄去培養(yǎng)基后每孔加入500μl新鮮的培養(yǎng)基。
3.?穩(wěn)定株篩選：
1)?72h以后，加入終濃度2μg/ml puromycin。每隔2-3天換一次終濃度2μg/ml puromycin新鮮培養(yǎng)基。
2)?藥物篩選約10天后，拍熒光照片。
3)?穩(wěn)定細(xì)胞株凍存。
四、?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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???????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. HeLa細(xì)胞感染慢病毒72h后照片，MOI為10
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????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖2. HeLa細(xì)胞感染慢病毒，篩選10天后穩(wěn)定株照片
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結(jié)論：從圖1可以看到，在MOI為10條件下，HeLa的感染效率約為80%。根據(jù)圖2，使用puromycin藥物篩選10天后，表達(dá)目的基因的HeLa的比例在90%以上，且熒光亮度增強(qiáng)。Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞株篩選成功。
五、?參考文獻(xiàn)
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