Luc-Pair? miR Luciferase Assay

應用報告基因研究轉錄后調控是細胞生物學研究和藥物發現領域的常用方法。早前，研究者著眼于研究轉錄水平的啟動子調節的活性。但是，現在轉錄后水平的調控被認為是細胞中另外一種重要的調控方式，例如：小分子RNA的干擾作用。小分子RNA中的代表：siRNA和miRNA被證實其在細胞翻譯后水平有著廣泛的調控作用。

熒光素酶基因是最廣泛的基因表達功能研究中的報告基因，它具有如下優點：

• 靈敏度高，檢測幅度寬
• 不是哺乳動物細胞內源性基因
• 重復性好
• 經濟實惠
• 96孔板設計，通用性強
• 可與HTS兼容

螢火蟲(Photinus pyralis)熒光素酶已被證實是檢測啟動子活性和監測基因轉錄后調控狀態的理想的報告基因。它是在細胞質中作用的酶，分子量61kDa并催化下列反應：

以前，應用螢火蟲熒光素酶檢測遺傳因子上調是比較容易的。但是由于檢測量綱對基因的下調表達定量過于狹窄，而且例如細胞死亡等非特異因素能降低熒光素酶，它并不是很適合于研究基因表達的下調。因此，通過以單個參比報告基因為標準均一化實驗中所用的報告基因就成為區分特異和非特異細胞應答效果影響的有效方法。均一化方法同樣是協調轉染效率差異和細胞活力差異的有效方法。

用亮度計或熒光讀取儀可以發現：發出熒光的光強和熒光素酶的數量成正比例關系。以前，應用螢火蟲熒光素酶檢測遺傳因子上調是比較容易的。但是由于檢測量綱對基因的下調表達定量過于狹窄，而且例如細胞死亡等非特異因素能降低熒光素酶，它并不是很適合于研究基因表達的下調。因此，通過以單個參比報告基因為標準均一化實驗中所用的報告基因就成為區分特異和非特異細胞應答效果影響的有效方法。均一化方法同樣是協調轉染效率差異和細胞活力差異的有效方法。

螢火蟲和海腎熒光素酶已經被廣泛應用于協同報告并進行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監測方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報告系統，因為它們來源于不同的生物進化方向，蛋白結構和底物差異都很大，在實驗中不會產生相互影響。

GeneCopoeia充分利用了螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶結構和底物的不同，優化并開發了方便的檢測體系可以方便連續地定量測定兩種熒光素酶的活性。兩種酶酶活活性的檢測可以依次在同一樣品里檢測出。螢火蟲熒光素酶的熒光可以被一種試劑激發，并且第二種試劑可同時淬滅螢火蟲熒光素酶的熒光和激發海腎熒光素酶酶的熒光。

GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Kit開發團隊給該產品帶來了幾點優勢和特點，可以增強產品的性能和增加產品的方便性。使用者可以充分感覺到以下幾點優勢：

1. 該系統已在好幾種不同的哺乳動物細胞中測試，經過優化處理可適合高通量監測儀器的micro-plate探頭，單孔樣品同樣可以被監測。
   
2. 該系統只能產生非常微弱的背景熒光（圖1）。從讀取數值可知：沒有差異值是必需的。

   圖表 1 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay的熒火蟲熒光素酶具有低背景的特點

3. 工作溶液I （溶液I中含有底物I）還有所有和裂解細胞有關的組分，并添加了可在同一反應液中與螢火蟲熒光素酶反應的底物和穩定劑。
4. 海腎熒光素酶緩沖液含有淬滅螢火蟲熒光素酶活性的成分。（圖2）
   

   圖表 2 加入溶液II后，螢火蟲熒光素酶的活性被淬滅。在6孔板中培養HEK293細胞培養一天后，轉染pEZX-MT01 質粒（miRNA的熒光素酶報告質粒）轉染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養24小時，檢測激發熒光。根據實驗步驟，96孔板的酶活依次被檢測。檢測完成后，只加溶液II（沒有底物II）到右邊半板的孔中。整塊板在Victor II機器上再次讀取熒光，大約95的螢火蟲熒光素酶的熒光被淬滅。

   
   
   
5. 試劑經過多次優化改進后，可以使得螢火蟲和海腎熒光素酶的信號相對穩定（圖3）。22°C加入適當試劑后30分鐘，螢火蟲熒光素酶的活性才只有原來的80，而海腎熒光素酶的活性15分鐘后才為原來的80。
   

   圖表 3 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的信號的穩定性。在6孔板中培養HEK293細胞培養一天后，轉染pEZX-MT01 質粒（miRNA的熒光素酶報告質粒）轉染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養24小時，檢測激發熒光。根據實驗步驟，96孔板的酶活依次被檢測。某A 公司的雙熒光報告系統檢測試劑盒用作參比。圖3a：螢火蟲熒光素酶的酶活信號；圖3b海腎熒光素酶的酶活信號。

   
   
   
   
   

6. 該系統被設計和優化出在多個數量級別范圍內穩定可信的熒光值和質粒濃度間穩定的線性結果。

   (a)	(b)

   圖4 檢測到的激發熒光（熒光酶酶活的度量）和轉化到HEK293 細胞中熒光素酶 質量的線性關系。 HEK293細胞在6孔板中培養一天后，轉染不同質量梯度（如圖所示）的GeneCopoeia pMRO or pEZX-MT01 質粒（miRNA的熒光素酶報告質粒）轉染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養24小時，檢測激發熒光。如圖所示：通過pMRO質粒檢測螢火蟲熒光素酶的酶活（圖：4a）；通過pEZX-MT01質粒檢測海腎熒光素酶的酶活（圖：4b）。

   
   
7. 可檢測3 UTR靶標克隆上靶標受到特定miRNA的抑制效應（圖：5）。HEK293細胞在6孔板中培養一天后，轉染1.0 mg的 3 UTR表達克隆 (pEZX-MT01-Lin28 UTR-fLuc)和 1.4 mg的miRNA 表達克?。ɑ?miRNA 參照質粒）。轉染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養24小時。通過Victor II儀器定量檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶酶活。螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶酶活以海腎螢光素酶酶活為基準進行均一化。

   圖表 6 在293T細胞里foskolin誘導的依賴CRE的熒光素酶表達

8. 在293T細胞里foskolin誘導的依賴CRE的熒光素酶表達（圖：6）。 螢火蟲熒光素酶基因可以被CRE元件控制（cAMP應答控件），該基因被穩定轉染到293細胞系后，細胞在96孔板里培養一天后，體系用不同濃度的foskolin（FSK，乙酰環化酶激活子）再處理16個小時。通過Victor II儀器定量檢測螢火蟲螢光素酶。（該實驗不涉及海腎熒光素酶的酶活）