Hieff NGS^® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對 Illumina^®高通量測序平臺專業開發設計的新一代建庫試劑盒。本產品采用高質量的酶學組成，在前一代建庫試劑盒的基礎上，改進了 DNA 片段末端修復和加 A 效率，同時改善接頭連接效率。本試劑盒采用了新型的高保真酶，顯著提高擴增均一性和保真性，可應用于常規動植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA 等樣本，助力獲得優異的測序數據。

• 適用500pg-500ng所有DNA樣本，包含cfDNA、FFPE等。
• 業界領先的文庫轉化率，最高可達70%以上。
• 多樣本驗證可獲得優異的文庫與測序數據。
• 嚴格的批次性能與穩定性質控。

Ultima Pro DNA 建庫試劑盒用于 FFPE 樣本建庫（未分選）

Ultima Pro DNA 建庫試劑盒用于 cfDNA 樣本建庫

-25~-15℃保存。

Q：機械法建庫試劑盒可用于哪些應用？

A：全基因組測序，靶向捕獲測序，擴增子測序，ChIP-Seq 等。

Q：機械法建庫試劑盒可用于哪些樣本？

A：常規動植物基因組 微生物基因組 FFPE cfDNA ChIP DNA 等。

Q：初始DNA 投入量范圍是多少？

A：500 pg-1 μg Fragment DNA 樣本。12201 適用于 500 pg-500 ng Fragment DNA 樣本

Q：12199 12200 12201 建庫試劑盒建庫接頭搭配選擇？

A：根據客戶需求提供。如完整接頭（Cat#12615-12618）：單端 48 index（如客戶需求更多 index 可咨詢技術）；單端短接頭(Cat#12611-12612)：單端 96 index；雙端短接頭(Cat#12412-12413)： 雙端 384 index；UDI 短接頭(Cat#12404-12407)：384 雙端唯一Index

Q：我們的建庫試劑盒里面包含接頭嗎？

A：我們所有建庫試劑盒都是不包含接頭的，接頭有設置單獨的貨號，可根據客戶選擇提供。

Q：12199 12200 12201 擴增模塊如何選擇？

A：翌圣提供兩種擴增模塊。高擴增效率模塊（Cat#12620）注重高效擴增，文庫產量高但保真度受影   響；高保真模塊（Cat#12621/12624）注重高保真擴增但文庫產量受影響，適用于后續 SNP 檢測。目前客戶如果需要高產量擴增，推薦 12199 Ultima 建庫試劑盒；如客戶后續做 SNP 檢測相關，可推薦12200 MaxUpⅡ DNA/12201 建庫試劑盒。

Q：12199 12200 12201 13310 13311 純化磁珠如何選擇？

A：Cat#12601，Hieff NGS DNA Selection Beads 或Cat#A63880，AMPure XP Beads 或其他等效產品。

Q：12199 12200 建庫一次需要多少磁珠？

A：

Q:建庫試劑盒本身不會造成文庫鋸齒狀，更多應考慮樣本和實驗過程問題：

A:1）Input DNA 量偏低。根據maxup II 說明書推薦，全基因組測序Input DNA 應大于 50ng，靶向捕獲測序Input DNA 應大于 10ng，目前客戶的上樣量偏低（1ng，10ng 和 50ng），可能造成建庫不成功。 2）樣本片段化不完全。部分酶法片段化方式，可能造成鋸齒狀。 3）PCR 擴增循環數過高。根據經驗，當 cycle 大于 15 個循環時，可能造成非均一擴增，呈現文庫鋸齒狀。

Q：文庫擴增的效率和保真性，怎么從這個圖中看擴增效率和保真性？

A：擴增效率即擴增一定產量所用的 PCR 循環數，相同產量PCR 循環數越低則擴增效率越高；保真性即 PCR 擴增時候出現堿基錯配的概率，錯配率越低則保真性越高。以 CanaceⅡ高保真酶為例，保真性是普通Taq 酶的 52 倍，是 Pfu 的 6 倍。高保真酶擴增的時候必來帶來一定的偏好性，會優先擴增中等GC 含量的片段，下圖即體現的是高保真酶的偏好性問題。正常情況下，若無 GC 偏好性，也就是說所有的片段經過相同的擴增之后都是一樣的。這時候藍色的圓圈點也就是與縱坐標1.0 直線重合。如果藍色圓圈在縱坐標 1.0 以上，則可能是出現對于該處 GC 含量的偏好性擴增導致。

Q：不同測序深度Coverage 解讀？

A：Coverage 即基因組覆蓋度，指的是測序獲得的序列占整個基因組的比例。不同測序深度下序列的coverage 肯定也是有差異的。簡單來說，10×意思就是說有 10 個測序 reads map 到基因組的某個位置，200×是說有 200 個測序 reads map 到基因組的這個位置。一般情況下測序深度越高，coverage 也會隨之降低。

Q：構建得到的文庫產量低

A： 1. DNA 質量低，樣本中含抑制物（抑制酶活性等） Input DNA 制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或者其他鹽，可能會影響末端修復以及 A 尾添加等步驟的反應效率，DNA 在TE 溶液中進行片段化，不要在無菌超純水中進行。 2.RNA 污染 樣本中存在RNA 污染會導致DNA 定量不準確，使文庫構建時DNA 上樣量不足。 3.PCR free 的時候上樣量不足 當使用完整接頭且Input DNA 大于 200 ng 時候，不用 PCR 擴增。如果文庫拷貝數過低不能進行直 接測序，可在接頭連接完成后對DNA 文庫進行PCR 擴增。 4.接頭出現降解：接頭存儲不當會出現降解，影響連接效率。一般稀釋過的接頭可在室溫放置 48h。 判斷接頭是否降解的方法： 用安捷倫 2100 毛細血管電泳檢測，通過電泳條帶大小判斷；如果未發生降解，則條帶大小大概為 62bp（complete adapter），如果發生降解，則無條帶或條帶很小。 用Qubit 酶標儀等檢測儀器進行濃度測量，粗略判斷接頭是否降解。 檢測方法：取 1uL，15uM 的complete 接頭（12615ES-12618ES）若 Qubit 檢測濃度 600ng/ul 左右，則 接頭正常，反之若小于 600ng/ul，則接頭可能降解成單鏈或小片段。酶標儀檢測同理。

Q：文庫電泳的時候條帶異常

A：1 出現小片段（60-120bp） 小片段一般為接頭片段或接頭所形成的二聚體，一般可用 12601 DNA 磁珠進行純化； 2.文庫富集之后出現大片段 一般文庫接頭在 120 bp 左右，若文庫片段增加幅度超過了 120bp 則可能是擴增過度，導致片段擴增異常。此時需減少PCR 循環數 3.接頭連接前片段異常片段化時間或者條件選擇不當。