Cre-LoxP重組酶系統載體構建服務

Cre-LoxP系統
Cre-Loxp系統策略是進行基因組定點突變的新途徑，可在DNA的特定位點上執行敲除、插入、激活、倒轉及易位等。該系統在80年代被引入后，已被成功的應用于酵母菌、植物、哺乳動物細胞培養及小鼠身上。Cre-LoxP系統包括Cre重組酶和Loxp位點兩個部分。
Cre重組酶是整合酶家族的一員，1981年從大腸桿菌噬菌體P1中發現，是最常用的位點特異性DNA重組酶。Cre基因有1029個堿基，Cre重組酶由343個氨基酸組成（約38kD），它不僅具有催化活性，而且跟限制酶相似，識別特異的DN A序列，如：loxP位點，引起重組。Cre重組酶有70%?的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結構的DNA底物，如線形、環狀甚至超螺旋DNA。
loxP位點是Cre重組酶作用的特異性重組位點，由兩個13 bp的反向重復序列和8 bp的間隔序列構成，長34 bp，具體序列如下：5’一ATAACTTCGTATA一GCATACAT一TATACGAAGTTAT一3’?/ 3’一TATTGAAGCATAT 一CGTATGTA一ATATGCTTCAATA一5’。 兩個反向重復序列是Cre的識別序列，中間的間隔序列是重組發生的位置，同時也決定了loxP位點的方向，根據loxP序列的排列方向產生不同的重組結果。

圖1. Cre重組酶結合loxP的位點

Cre-loxP系統的原理
Cre-loxP系統存在以下幾種誘導重組的方式，這是基于Cre重組酶與loxP位點的相互作用而實現的。當基因內存在loxP位點且有Cre重組酶存在時，Cre重組酶便會與loxP位點兩端的反向重復序列區結合形成二聚體。此二聚體與其他loxP位點的二聚體結合，進而形成四聚體。隨之，loxP位點之間的DNA序列被Cre重組酶切掉，切口通過DNA連接酶重新連接。DNA重組結果主要取決于loxP位點的方向及位置
Cre重組酶介導的兩個loxP序列間的特異性重組根據序列位置和方向的不同分為三種 情況：①當兩個loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相同時Cre重組酶能夠敲除兩個loxP序列間的DNA片段；②當兩個loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相反時，Cre重組酶能夠反轉兩個loxP序列間的DNA片段；③當兩個loxP序列位于不同DNA鏈上時，Cre重組酶能夠介導loxP序列間DNA鏈的交換或染色體易位。Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程。

圖2. Cre-loxP系統誘導重組的方式

Cre-loxP系統的優點

1. 高效性；

2. 時空特異性；

3. 應用范圍廣。

• 條件性基因敲除小鼠的構建

1. 轉基因動物依賴的基因敲除

1. 利用原核注射的方法獲得轉基因“Cre小鼠”。在Cre基因上游加入特異性啟動子，利用啟動子控制Cre重組酶的表達；
2. 在胚胎干細胞（ES）中通過置換型載體進行同源重組，向基因組靶位點引入選擇標記基因，并在其兩側引入兩個同向排列的Loxp位點。兩條同源染色體都帶有 Loxp位點且引入的Loxp位點不能干擾靶基因的轉錄。將該ES細胞打入假孕母鼠中，發育成“floxed小鼠”；
3. “Cre小鼠”和“floxed小鼠”交配，Cre重組酶會在特定組織細胞表達，并切掉Loxp位點之間的靶基因和1個Loxp位點，從而達到靶基因的失活或敲除。

2. 病毒依賴的基因敲除

1. 通過轉基因動物辦法獲得“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；
2. 注射Cre病毒進loxP轉基因小鼠體內，或者注射loxP病毒到Cre轉基因小鼠體內，引入Cre或loxP元件。

1. 對Cre元件的改造：在Cre元件的C端接上雌激素受體（ER）的配體結合結構域，為了避免體內雌激素的干擾，可對雌激素受體的配體結合區做一定程度的改變，使其只能和某些雌激素衍生物相結合。目前使用最多的是Cre-ERT2突變體，融合蛋白Cre-ERT2不能入核，定位在胞漿內，當雌激素衍生物tamoxifen結合到Cre-ERT2受體結合結構域后，蛋白才會通過構象變化從錨定蛋白HSP90上解離下來，進入細胞核，識別loxP位點并發生重組。通過控制tamoxifen的注射時間，就可以調控基因重組的時間特異性。

2. 對loxP元件的改造：loxP元件也可以在間隔區和回文序列進行突變，不同的堿基選擇就造就了不同的lox位點，常見的有 lox2272、lox511、lox5171、loxN和loxP等。突變后的loxP序列和同樣突變的loxP序列匹配，才能被Cre重組酶識別和重組，而不能和未突變的loxP序列匹配，這樣就可以將不同的loxP序列組合用于控制多個基因，在Cre重組酶的作用下，實現多個基因的重組。Brainbow技術就是根據loxP序列的改造而實現的。

3. 四環素誘導型tetO-Cre：將四環素調控系統與Cre-loxP系統相結合，需要用兩種轉基因小鼠交配使用。一種是由四環素響應啟動子元件（TRE, 也叫?tetO）控制的Cre工具鼠（TRE-Cre, 也叫tetO-Cre）；另一種是由組織特異性啟動子驅動的表達四環素轉錄活化因子?tTA?或?rtTA的小鼠。tTA或rtTA與tetO的結合受四環素或其衍生物強力霉素（Dox）的調節。tTA在沒有Dox的時候與tetO結合誘導Cre表達，有Dox的時候不能與tetO結合，Cre不表達；rtTA與tTA相反，有Dox的時候與tetO結合，誘導Cre表達，沒有Dox的時候與tetO不結合，Cre不表達。因此可以通過Dox來調控Cre在特定時間及特定組織細胞中的表達，從而介導基因重組。