產品簡介

MycAway™ 支原體 qPCR 檢測試劑盒(探針法)是基于 NAT(nucleic acid amplification techniques)的一種快速定性檢測生產原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產品。該試劑盒基于定量 PCR 技術，采用多重 PCR 的方法，使用 2 種熒光探針，FAM 和 VIC，分別檢測目標序列和內參?？筛采w 100 多種支原體 DNA 序列；并且嚴格按照 EP 2.6.7 進行專屬性、檢測限、耐用性驗證，檢測限滿足≤10 CFU/mL 的要求，具備靈敏度高、特異性好、安全性好等特點。

本產品能夠與利用手動提取方法的 MolPure® 磁珠法殘留 DNA 樣本前處理試劑盒（Cat#18461）搭配使用。樣本中的核酸同樣也可以使用 Auto-Pure 32A 全自動核酸提取儀（Cat#80501）和 MolPure® 磁珠法殘留DNA 樣本前處理試劑盒 FA(預封裝)（Cat#18462）自動提取樣本核酸（請注意，試劑盒貨號 Cat#18461 和 Cat#C230106 都已經過完全驗證，如需詳細驗證信息，可以聯系我司技術支持）。樣本經過前處理去除干擾雜質獲得純化的支原體 DNA 后，使用qPCR 儀進行 qPCR 反應后收集探針的熒光信號，從而對檢測結果進行分析。

產品規格

組分信息

* 內部對照（IC）：Internal control；

** 陽性對照（PCS）：Positive control solution，濃度為 1,000 copies/µL；

*** DNA 稀釋液：用于樣本和 IC 稀釋、以及 NTC 和 NCS 的模板；

**** 超純水：用于制備 qPCR Mix 體系。

運輸與儲存

25~-15℃保存，有效期 1 年。

*收到貨后，請檢查各組分是否齊全，如不立即開封各組分做實驗，需立即放入-25~-15℃中保存。注意 C230106-B 需要避光保存。

使用說明

1.實驗前準備

1)提前準備實驗所需試劑耗材；

2)確認儀器適配性：

本試劑盒適配的 qPCR 機型包含但不限于以下儀器：

A:Bio-Rad: CFX96

B:Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System；QuantStudio™ 5；

2.實驗方法

1）待測樣本 DNA 提取

建議使用 Arcegen 的“磁珠法殘留 DNA 樣本前處理試劑盒”提取樣本 DNA，產品貨號為 Cat#18461ES（用于手動提?。┖虲at#18462ES（用于自動提?。?，您可以在Arcegen官網查詢該產品的詳細信息和購買該產品。本試劑盒（Cat#C230106ES）中包含內部對照（IC）。如果在 DNA 提取前將 IC 加入樣品中，可以驗證整個過程（包括 DNA提取和 qPCR 反應）。如果將 IC 直接添加到qPCR Mix 中，IC 將僅作為 qPCR 對照。

2）qPCR 反應體系的準備

a.根據所要檢測樣本的數量，包括陽性對照（PCS），無模板對照（NTC），抽提陰性對照（NCS）和待測樣本（TS），  根據實驗設計，計算所需反應孔數，一般每個樣本做 2 個重復孔。

*陽性對照（PCS）：Positive control solution；無模板對照（NTC）：No template control；抽提陰性對照（NCS）：Negative control solution；

待測樣本（TS）：Test sample。PCS 和 NTC 為無需進行提取前處理的樣本；NCS 和 TS 為需要進行提取前處理的樣本。

反應孔數（M1）=（1×NCS + N×TS）×2

反應孔數（M2）=（1×PCS + 1×NTC）×2

反應孔數（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS）×2

b.根據實驗設計以及下面對應表格中的反應體系，提前將所需試劑放置冰上融化。

c.根據反應孔數計算所需要的qPCR Mix 的量。注意，如果使用該產品用于產品放行等 GMP 活動中，則推薦按照表 1 和表 2 配置體系；如果僅用于研發實驗中，用戶自行評估實驗情況后認為無需提取前將IC 加入 TS 中或無需做 NCS 對照，也可按照表 3 配置體系。并非 M1，M2，M3都需要配制。

表 1 反應孔數（M1）對應的 qPCR Mix 體系

*表 1 中的配置體系是基于 NCS 和 TS 都是在提取前加入 IC 的前提下，則無需在配置 qPCR Mix 時再加入 IC。提取前加入 IC 的方法：首先將試劑盒 IC 用 DNA 稀釋液稀釋 20 倍，每 100 μL 檢測樣本加入 1 μL 稀釋后的 IC 后進行提取。

**本試劑盒不含 ROX 參比染料，若您目前使用的 Real Time PCR 擴增儀需要添加 ROX 參比染料，推薦您購買本公司的 50× ROX Reference Dye

（Cat#10200ES），以使用本產品為例，添加體積為 0.8 μL，見表 1。如果使用其他品牌的 ROX 產品，請具體參考其說明書進行 ROX 添加。若不需要添加 ROX 參比染料，則添加體積為 0 μL。

表 2 反應孔數（M2）對應的 qPCR Mix 體系

*表 2 中的配置體系是基于 PCS 和 NTC 都是未在提取前加入 IC 的前提下，則需要在配置 qPCR Mix 時加入 IC。提取后加入 IC 的方法：將 IC 用 DNA稀釋液稀釋 100 倍后每個反應體系中加 1 μL。

**本試劑盒不含 ROX 參比染料，若您目前使用的 Real Time PCR 擴增儀需要添加 ROX 參比染料，推薦您購買本公司的 50× ROX Reference Dye

（Cat#10200ES），以使用本產品為例，添加體積為 0.8 μL，見表 2。如果使用其他品牌的 ROX 產品，請具體參考其說明書進行 ROX 添加。若不需要添加 ROX 參比染料，則添加體積為 0 μL。

表 3 反應孔數（M3）對應的 qPCR Mix 體系

*表 3 中的配置體系是基于提取前樣本中不加入 IC 的前提下，則需要在配置 qPCR Mix 時加入 IC。提取后加入 IC 的方法：將 IC 用 DNA 稀釋液稀釋 100 倍后每個反應體系中加 1 μL。

**本試劑盒不含 ROX 參比染料，若您目前使用的 Real Time PCR 擴增儀需要添加 ROX 參比染料，推薦您購買本公司的 50× ROX Reference Dye

（Cat#10200ES），以使用本產品為例，添加體積為 0.8 μL，見表 3。如果使用其他品牌的 ROX 產品，請具體參考其說明書進行 ROX 添加。若不需要添加 ROX 參比染料，則添加體積為 0 μL。

3)加樣

A.充分震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

B.向每孔反應管中分裝 20μL 對應樣本的 qPCR Mix。注意，各樣品管中分裝的 qPCR Mix 需要與上一步“qPCR 反應體系的準備”中配置的 qPCR Mix 保持一致，與樣品一一對應，避免加錯。

 C.向已分裝過qPCR Mix 的反應管中加入樣品，參考表 4。

**每管或孔中最終反應體積為 40μL。

*NCS 推薦使用 DNA 稀釋液作為樣本進行前處理。

表 4 加樣示例

***注意蓋上反應管蓋子或者貼上光學膜，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標記，或者用刮板反復摩擦。

****完成加樣后，先短時低速離心反應管或反應板，再充分震蕩混勻然后短時低速離心，將管蓋和管壁的殘留液體收集至管或板底。操作時盡量避免氣泡產生。這一步非常重要，不混勻或者混勻不徹底會影響基線平穩。

4)qPCR 程序參數設置

A.程序文件設置：

以 Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System 儀器和 Real-Time PCR Software v2.4 為例：儀器類型：7500 (96 Wells)

實驗類型選擇：Quantitation-Standard Curve；檢測目標序列的試劑：Taqman® Reagents

程序速度：Standard (~2 hours to complete a run)

B.檢測通道設置：

在“Plate Setup”的“Define Targets and Samples”中，創建 Target 1 通道（FAM），選擇報告熒光基團為FAM，猝滅熒光基團為 MGB 或none；創建 Target 2 通道（VIC），選擇報告熒光基團為 VIC，猝滅熒光基團為 none。在“Plate Setup”   的“Assign Targets and Samples”中，如果沒有額外加入 ROX 染料，則選擇“none”；如果額外加入了 ROX，則選擇“ROX”。

c. 標準擴增程序設置：

表 5 標準擴增程序

d. 基線和閾值設置：

基線調整原則：基線通常按照自動設置的基線即可。如需手動調整，基線起始循環數選擇在指數增長期之前，其中起點設置需要避開起始熒光采集的波動區，終點選擇在最早出現指數擴增樣本的 Ct 值的前 1-2 個循環。

閾值設置原則：通常采用自動閾值。如需手動調整，閾值線要高于陰性對照或者基線噪音，通常設置在樣本重復性較好的指數增長期的后期，不同通道需要設置相對獨立的、合適的閾值線。

5）結果分析

a.PCS、NTC 和NCS 結果判斷:

若反應體系中加入了 IC，則各質控樣品需要滿足表 6 中條件：

表 6 PCS、NTC 和 NCS 結果判斷

若反應體系中未加 IC：各質控樣品需要滿足表 6 中 FAM 信號一列的條件，無需分析 VIC 通道。

b.待測樣本 TS 檢測結果判斷：

前提條件：判斷樣本 TS 檢測結果前，需要先判斷各質控品即 PCS、NTC 和 NCS 是否通過表 6 中的標準。若通過則可以進行下一步；若未通過，則樣本 TS 的結果可能不可靠，需要調查原因。

若反應體系中加入了 IC，則根據樣本FAM 信號和 VIC 信號的結果找到表 7 中對應的結果判斷：

表 7 待測樣本結果判斷（加 IC 時）

*VIC 信號如果有抑制，需重測或對樣本進行合適處理消除抑制因子

若反應體系中未加 IC：無需分析 VIC通道，只需要根據表8中樣本FAM信號的結果找到對應的結果判斷：

表 8 待測樣本結果判斷（未加 IC時）

注意事項

1）使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

2）加樣和配液步驟都盡量在冰上操作。

3）每個組分在使用前都應震蕩混勻，低速離心。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5）本產品僅作科研用途。