流式分選/流式檢測細胞凋亡/流式檢測細胞周期

流式分選

流式細胞術(Flow?Cytometry,?FCM)是七十年代發展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體,它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,?還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。

服務內容：

淋巴細胞、造血干細胞、內皮細胞和成纖維細胞等多種細胞的分選。

客戶須知：

客戶須按流式細胞分選要求制備細胞樣品，保證實驗樣品的絕對無菌，并同時提供陰性對照樣品。

客戶在提交樣本前，需附詳細書面說明材料，說明實驗目的、樣品來源及處理方法等信息，并詳細說明檢測要求。

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流式細胞術檢測細胞凋亡?

操作步驟
1、用預冷的PBS洗滌細胞兩次,之后用1X的結合緩沖液重懸細胞, 調節細胞濃度到1X106Cells/ml;
2、取100μl調節好濃度的細胞懸液到5ml流式管底部;
3、加入Annexin V標記蛋白和相應的核酸染料(標記的Annexin V與核酸染料均需要摸索到合適的使用濃度,商品化試劑盒按照說明書操作);
4、均勻混合,室溫避光反應15分鐘;(若是用Annexin V-Biotin標記蛋白染色,反應后用1X的結合緩沖液洗滌細胞一次,再加入合適濃度的標記鏈霉親和素Streptavidin,再加入合適的核酸染料,室溫避光反應15分鐘)
5、向流式管中加入400μl 1X的結合緩沖液,重懸后及時上流式細胞儀進行分析.操作注意事項

1、補償對照管很重要;
2、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞;
3、細胞濃度與染色用的蛋白量要合適;
4、對不同藥物濃度和藥物作用時間要進行摸索;

儀器：

實驗所用的流式細胞儀為COULTER EPICS XL。

樣本要求：

1）單個細胞：1~2×106 個細胞左右;來源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右;來源于人、小鼠、大鼠或其它。

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流式細胞儀進行細胞周期檢測（PI）

細胞周期的定義
生命是從一代向下一代傳遞的連續過程，因此是一個不斷更新、不斷從頭開始的過程。細胞的生命開始于產生它的母細胞的分裂, 結束于它的子細胞的形成，或是細胞的自身死亡。通常將通過細胞分裂產生的新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經歷的過程稱為細胞周期。在這一過程中，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。

PI能夠插入雙鏈DNA中。它被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡的細胞的細胞膜。
1）PI單染色的固定方法：
1．收集細胞（1～5）×106個，500～1000r/min離心5min，棄去培養液。
2．3ml PBS洗一次。
3．離心去PBS，加入冰預冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．離心棄去固定液，3ml PBS重懸5min。
5．400目的篩網過濾1次，500～1000r/min離心5min，棄去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發熒光，激發光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光，可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。

2）方法：
將樣品細胞按程序描述的方法用FITC標記的單克隆抗體進行單色染色。
A、在最后的洗滌步驟后，將樣品細胞懸浮于PI緩沖液中，于4℃下密封避光保存以備通過流式細胞儀分析；
B、在最后的洗滌步驟后，如前述將樣品細胞懸浮后備用。如果您想檢測樣品細胞活力，在每一管中加入2μl的PI濃縮液，混勻。將樣品置于4℃下密封避光保存以備流式細胞儀分析。

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