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 谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B（GST 標簽純化樹脂）說明書
貨號：P2020
規格：5ml/10ml
保存：4℃保存，有效期至少一年
產品簡介：
pGEX載體表達的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉移酶融合，因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。
GSTs 是一類以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作為底物，通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由
于GST 對底物的親和力是亞毫摩爾級的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST 及其融合
蛋白的純化效率很高?？梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結合GST 融合蛋白。樹脂用3mol/L NaCl 的緩沖
液再生。
谷胱甘肽瓊脂糖對GST 融合蛋白的結合能力很強（每毫升柱床體積的樹脂能結合8 毫克融合蛋白）。
特性:
粒度：45-165um 流速：75cm/h
工作PH:4-10 耐壓:0.3Mpa
載量:＞5mg 谷胱甘肽 S-轉移酶
使?說明：
谷胱甘肽樹脂的處理:
1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿。
2.取部分勻漿放入15ml 聚丙烯管（每100ml 細菌培養物大約需要2ml 勻漿）。
3.4℃ 500 g 離心5 分鐘，小心去掉上清。
4.在樹脂中加入10 倍柱床體積預冷的PBS，顛倒數次混勻，4℃ 500 g 離心5 分鐘，小心去掉上清。
5.每毫升樹脂加入1 毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數次，混合均勻，懸液冰上放置待用。
制備細胞抽提物：
6.每100 毫升培養物的細胞沉淀重懸于4mlPBS 緩沖液中。
7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml,冰上放置30 分鐘。
8.用針筒將10ml 濃度為0.2%的TritonX-100 強行注入黏稠的細胞裂解物中，劇烈振動數次混勻。加入
DNase 和RNase 至終濃度5ug/ml, 4℃振動溫育10 分鐘，4℃ 3000 g 離心30 分鐘，去除不溶性細胞碎片，上
清轉移到一只新管中，加入DTT 至終濃度1mmol/L。
純化融合蛋白：
9.細胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和，每100 毫升細菌培養物加2ml 樹脂，于室溫輕
搖30min。
10.混合物于4℃以500 g 離心5 分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。
11.沉淀中加入10 倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白。
12.4℃以500 g 離心5 分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。
13.重復步驟11 和12 兩次。
14.結合的GST 融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa 因子切割，釋放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：
a.沉淀中加入1 倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min，洗脫樹脂上結合的蛋白。
b. 4℃以500 g 離心5 分鐘，上清（含洗脫的融合蛋白）移至新管中。
c.重復步驟a 和b 兩次，合并3 次上清。
蛋白酶解從結合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：
a. 在結合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa 因子（根據融合蛋白中的位點選擇），每ml
樹脂加入50 單位溶于1mlPBS 的蛋白酶。顛倒離心管數次混勻，室溫下振蕩2—16 小時。用小規模實驗確定
精確時間。
b.4℃以500 g 離心5 分鐘，上清小心移至新管中。（GST 仍結合在樹脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也
在上清中，仍需要分離）
15.10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質組成。
試劑配制：
谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)
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