點突變

簡介

? ? ? CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系統是目前被廣泛運用的基因編輯系統，其原理是由CRISPR轉錄產生的gRNA介導Cas核酸酶靶向目標序列，對序列進行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系統，此系統是由II類CRISPR/Cas系統改造而來，能夠在植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物等多種細胞中，進行有效的靶向編輯，具有操作簡易、效率高、以及作用靶位點多等優勢。

? ? ? CRISPR/Cas9系統中sgRNA（short guide RNA）識別并結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪切，產生DNA雙鏈斷裂，通過細胞內的同源重組修復方式，將外源供體DNA定點導入至基因組的靶位點中，從而實現基因敲入。

CRISPR/Cas9基因敲入示意圖（Eric Murillo-Rodríguez et al., Sleep and Vigilance, 2018）

? ? ? 將同時包含Cas9和gRNA序列的質粒載體與攜帶點突變的Donor載體（Oligo）共轉入細胞核，Cas9和gRNA的復合物會引起靶位點DNA雙鏈斷裂，而后細胞以外源攜帶目標點突變的Donor作為模板進行同源重組修復，將目標點突變重組到基因組靶位點。Cas9和gRNA的質粒載體攜帶抗性基因，可進行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出點突變純合的陽性克隆。

圖1.點突變方案

圖2.點突變載體

服務流程

應用

? ? ? 1、細胞疾病模型造模

? ? ? ? ? ??通過HDR，攜帶點突變序列的donor oligo (ssODN)替換WT對應的堿基。

? ? ? 2、細胞疾病模型修復

? ? ? ? ? ??通過HDR，攜帶WT序列的donor oligo (ssODN)替換對應的突變堿基。

參考文獻

? ? ? [1]Eric Murillo-Rodríguez, Rocha N B , André Barciela Veras, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J]. Sleep and Vigilance, 2018, 2(1):1 3-21.