?——即抗體C端K缺失比例分析技術服務

抗體類蛋白質藥物分子重鏈C末端賴氨酸會有不同程度的缺失現象發生，質量控制中需要建立對這類現象的定性和定量分析的方法。C端賴氨酸 (K) 缺失后，會造成供試品酶解后C末端多肽分子的序列發生變化，并且這兩種C末端多肽分子（缺失或者不缺失K）的定量結果可以反映蛋白質分子C端賴氨酸的缺失程度。

現代分析技術的發展，使得LC-MS技術可以運用到對多肽分子的定性和定量實驗中。因此，本實驗需要在合成供試品的理論C端多肽分子和缺失賴氨酸C端多肽分子的基礎上，使用外標法建立起對供試品的C端賴氨酸缺失程度的定性定量方法。

圖為Orbitrap示意圖

“生物質譜技術可以在蛋白質樣品的翻譯后修飾定性定量分析中得到廣泛應用”

生物質譜技術在定量分析中的應用

對C末端K缺失進行測定主要方法是基于質譜鑒定中的SIM掃描。SIM全稱是單離子檢測掃描（single ion monitoring，單離子監測），只針對一級質譜而言，即只掃一個離子，對于已知的化合物，提高某個離子的靈敏度，并排除其它離子的干擾。另外，LC-MS技術在進行定量實驗時，常用三重四級桿進行MRM，但隨著技術發展，質譜的分辨率和動態范圍都有很大的提高。

技術指標

本方法所檢測的樣品是蛋白質或多肽類供試品，測量的是蛋白質C末端多肽分子賴氨酸缺失比例，測定的是多肽分子的氨基酸序列和其相對強度。

蛋白質或者多肽供試品既可以是固體樣品，也可以說溶液樣品。供試品的量應該不少于200μg，供試品如果為固體，應為蛋白質多肽凍干制品；如果供試品為液體，樣品中蛋白質多肽濃度應盡可能在2mg/ml以上。

本方法采用外標法。標準品的標準曲線線性相關度應大于0.9。質譜數據經軟件MASCOT分析，鑒定肽段的significant P需小于0.05，且Mascot Score值需大于20。

蛋白質C末端測定方法所使用的儀器是，Thermo公司生產的高校液相串聯質譜儀Q Exactive和Easy Nlc1000。

案例分析

下圖顯示一個K缺失實驗中標準肽段的標準曲線（XIC積分值）。

下圖為抗體蛋白質供試品的C末端K缺失比例的XIC圖譜。

Q&A

1)????抗體C端K缺失比例分析實驗參數的簡介。

2)??????質譜定量實驗中的內標法和外標法選擇。

內標法是在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內標物質以校準和消除出于操作條件的波動而對結果產生的影響。采用內標法定量時，內標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內標物應當是一種能得到純樣的已知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中去，它應當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學性質、色譜行為和響應特征，最好是被分析物質的一個 同系物。當然， 在色譜分析條件下，內標物必須能與樣品中各組分充分分離。

外標法不是把標準物質加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標物與被測組分同為一種物質但要求有一定的純度，分析時外標物的濃度應與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準確性。