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產(chǎn)品簡介

Annexin V-Alexa Fluor 488/7-AAD凋亡檢測試劑盒是用綠色熒光染料Alexa Fluor 488標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

檢測原理：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可穿透晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V- Alexa Fluor 488與7-AAD聯(lián)合使用時(shí)，7-AAD則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被Annexin V-Alexa Fluor 488和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。

組分信息

儲存條件

2~8℃儲存，勿冰凍。Annexin V-Alexa Fluor 488、7-AAD需避光存儲。有效期1年。

注意事項(xiàng)

1、由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。

2、貼壁細(xì)胞的消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免機(jī)械損傷。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。盡量不用含EDTA的胰酶消化液，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。

3、如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。血小板含有PS，可與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并以200 g離心洗去血小板。

4、試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體集中至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落引起損失。

5、Annexin V-Alexa Fluor 488和7-AAD是光敏物質(zhì)，操作時(shí)請注意避光。

6、7-AAD為潛在致癌物，為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

7、本產(chǎn)品僅用于科研。

使用說明

一、樣品染色

1、懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性。

2、配制1×Binding Buffer：用去離子水4倍稀釋4×Binding Buffer（4 mL 結(jié)合緩沖液+12 mL 去離子水）。

3、用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300 g，4℃離心5 min。

4、加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×10⁶細(xì)胞/mL。

5、取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488，輕輕混勻后于室溫避光孵育5min。

6、加入10 μL 7-AAD（20µg/mL）。

7、加入400 μL PBS Buffer，混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)檢測。

【注意】為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

二、觀察檢測

1、流式細(xì)胞儀

用流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-Alexa Fluor 488的激發(fā)波長Ex=495 nm，發(fā)射波長Em=519 nm，建議使用FL1通道檢測；7-AAD的激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm，發(fā)出紅色熒光，建議使用FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），Alexa Fluor 488為橫坐標(biāo)，7-AAD為縱坐標(biāo)。每個(gè)樣采集10,000 events。典型的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，活細(xì)胞僅呈現(xiàn)很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞呈綠色和紅色熒光雙重染色。

熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

2、熒光顯微鏡

1）滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。

2）用PBS洗滌細(xì)胞兩次。

3）在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-Alexa Fluor 488，5 μL 7-AAD染液混勻。

4）將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。

5）室溫避光孵育5 min。

6）將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-Alexa Fluor 488熒光信號呈綠色；7-AAD熒光信號呈紅色。