產品簡介

Annexin V-Alexa Fluor 488/7-AAD凋亡檢測試劑盒是用綠色熒光染料Alexa Fluor 488標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發生，可用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。

檢測原理：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合，可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發射光譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯合使用。該染料不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可穿透晚期凋亡細胞或者壞死細胞并與其內的DNA結合。因此將Annexin V- Alexa Fluor 488與7-AAD聯合使用時，7-AAD則被排除在活細胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Annexin V-Alexa Fluor 488和7-AAD結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。

組分信息

儲存條件

2~8℃儲存，勿冰凍。Annexin V-Alexa Fluor 488、7-AAD需避光存儲。有效期1年。

注意事項

1、由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。

2、貼壁細胞的消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免機械損傷。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。盡量不用含EDTA的胰酶消化液，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。

3、如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。血小板含有PS，可與Annexin V結合，從而干擾實驗結果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并以200 g離心洗去血小板。

4、試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體集中至管底，避免開蓋時液體灑落引起損失。

5、Annexin V-Alexa Fluor 488和7-AAD是光敏物質，操作時請注意避光。

6、7-AAD為潛在致癌物，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

7、本產品僅用于科研。

使用說明

一、樣品染色

1、懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞。貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2、配制1×Binding Buffer：用去離子水4倍稀釋4×Binding Buffer（4 mL 結合緩沖液+12 mL 去離子水）。

3、用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g，4℃離心5 min。

4、加入1×Binding Buffer重懸細胞，調節其濃度為1-5×10⁶細胞/mL。

5、取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488，輕輕混勻后于室溫避光孵育5min。

6、加入10 μL 7-AAD（20µg/mL）。

7、加入400 μL PBS Buffer，混勻，樣品在1小時內檢測。

【注意】為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

二、觀察檢測

1、流式細胞儀

用流式細胞儀檢測，Annexin V-Alexa Fluor 488的激發波長Ex=495 nm，發射波長Em=519 nm，建議使用FL1通道檢測；7-AAD的激發波長Ex=546 nm；發射波長Em=647 nm，發出紅色熒光，建議使用FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），Alexa Fluor 488為橫坐標，7-AAD為縱坐標。每個樣采集10,000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅呈現很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅呈現較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞呈綠色和紅色熒光雙重染色。

熒光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。

2、熒光顯微鏡

1）滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

2）用PBS洗滌細胞兩次。

3）在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-Alexa Fluor 488，5 μL 7-AAD染液混勻。

4）將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。

5）室溫避光孵育5 min。

6）將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-Alexa Fluor 488熒光信號呈綠色；7-AAD熒光信號呈紅色。