質粒小量提取試劑盒說明書
貨號：D1100
規格：50T/100T
保存：常溫保存，復檢期一年。
試劑盒內容：
試劑盒組成
D1100-50T
D1100-100T
RNase?A
300ul
500ul
溶液Ⅰ
15ml
30ml
溶液Ⅱ
15ml
30ml
溶液Ⅲ
20ml
40ml
漂洗液
15ml
15ml×2
洗脫液
15ml
30ml
吸附柱
50個
100個
收集管
50個
100個
說明書
1份
1份

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產品說明：
本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據離心吸附柱在高鹽狀態下特異性地結合溶液中的DNA的原理特異性提取質粒DNA。?離心吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。?使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的?RNaseA?全部加入），混勻，置于?2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。?
操作步驟:
1、取1-5ml細菌培養物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
2、向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。
3、向離心管中加入250ul溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過5?min，以免質粒受到破壞。
4、向離心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心10?min，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶切、PCR等。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200ul經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
10、為了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
注意事項:
1.?使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。溶液Ⅱ?、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。
2.?洗脫緩沖液體積不應少于50ul，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)，?pH值低于7.?0會降低洗脫效率，?DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。
3.?如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒，應加大菌體使用量，使用5-10ml過夜培養物，同時按照比例增加溶液Ⅰ?、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當的延長時間，以增加提取效率。
4.?DNA濃度及純度檢測：得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。?得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。?DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA、?40ug/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。?
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