? ? ? ?細胞凋亡?(Apoptosis)是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，凋亡是細胞的主動過程，涉及一系列基因的激活、表達以及調控等，為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。

? ? ? 細胞凋亡的主要形態學特征是染色質斷裂為大小不等的片段，并與某些細胞器一起聚集，為反折的細胞膜包圍，形成凋亡小體。碧云天可以提供多種方法的細胞凋亡檢測服務：如磷脂酰絲氨酸外翻分析法（Annexin V法）、TUNEL法、凋亡相關基因及蛋白檢測等。?

凋亡細胞的基本特征包括：

1.?胞質凝縮，染色質聚集及邊緣化，細胞核崩解，細胞以出芽的方式形成凋亡小體，并被鄰近的巨噬細胞等吞噬消化。

2.?膜內側磷脂酰絲氨酸外翻。?

3.?凋亡過程中細胞內溶物不被釋放，故不會引起炎癥反應。

4.?凋亡細胞中仍存在蛋白質的合成反應。

5.?內切核酸酶被活化，導致染色質DNA在核小體連接處斷裂，形成180~200bp整數倍的核酸片斷，凝膠電泳圖譜呈梯帶狀（DNA ladder)等。 ?

一、形態學檢測：根據凋亡細胞固有的形態特征，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。

1. 光學顯微鏡和倒置顯微鏡：?

未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。??

染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。??

熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡：一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。?

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法) ?

磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細胞膜的內側，在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、EGFP、PE)或biotin標記，以標記的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。??

三、線粒體膜勢能的檢測??

? ? ? 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)出現之前。

? ? ? JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，產生綠色熒光。這樣就可以通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。??

四、DNA片斷化檢測方法

? ? ? 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析?收集細胞，70%冷乙醇(in PBS)4°C固定過夜，PBS洗滌，1000rpm離心?10min，RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min，碘化丙啶(50mg/ml)染色，?室溫避光15min，FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。??細胞凋亡主要的特征是染色質濃縮, 染色質DNA斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段。??

五、TUNEL法??

? ? ? 細胞凋亡中, 染色體DNA斷裂產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。??TUNEL能準確地反應細胞凋亡的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。??

六、Caspase家族活性的檢測??

? ? ? ?Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著重要作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。??

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