?hsa-mir-21過表達載體構建

摘要：以人基因組DNA為模板擴增hsa-mir-21前體序列，并構建入慢病毒載體pGIPZ。在該載體中hsa-mir-21前體序列被插入到tGFP以及puromycin抗性基因的3‘UTR區。tGFP利于后續的表達觀測， 而puromycin抗性基因則利于穩定細胞株的篩選。測序證實載體構建成功，該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成慢病毒用于穩定株的篩選以及在動物水平過表達hsa-mir-21。
關鍵詞：microRNA，過表達， hsa-mir-21， puromycin， lentivirus vector

一、?實驗原理
以人基因組DNA為模板PCR擴增hsa-mir-21基因前體序列，并構建入慢病毒載體pGIPZ中。載體圖譜如下：

????????????????????????????????????????????
二、?實驗目的
構建既可用于瞬時轉染又可用于穩定株篩選的hsa-mir-21過表達慢病毒載體。

三、?實驗方法
以人基因組DNA為模板PCR擴增hsa-mir-21基因前體序列，并構建入慢病毒載體pGIPZ中。表達載體酶切后回收線性化的載體片段。目的基因片段與線性化的載體片段經同源重組后轉化E.coli感受態細胞。用菌落PCR鑒定轉化子，陽性克隆送測序。測序無誤的克隆進行質粒抽提。

1.?引物設計：
從GenBank中查詢目的基因上下游的序列，用Vector NTI軟件進行引物設計。
PCR擴增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶擴增目的片段，反應體系和條件如下：

?

2.?瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果：
目的片段PCR擴增成功后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測①，通過和DNA Marker的對比，判斷目的片段是否擴增成功。
3.?膠回收目的片段：
把目的片段條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4.?線性化表達載體的制備：
用限制性內切酶對表達載體進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg， 10 x反應Buffer 5μl，限制性內切酶各1μl，去離子水補足50μl，于37℃水浴鍋孵育2h以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?目的片段同源重組到線性化表達載體中：

將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2:1加到離心管中進行重組反應：

?
混勻后在42℃孵育30min，然后轉移到冰上。放置2-3min后取10μl反應液體轉化到感受態細胞中。
6.?感受態細胞的制備和轉化：
DH5α感受態細胞的制備和轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》。
7.?菌落PCR鑒定陽性轉化子：
挑取平板上長出的轉化子重懸于10μl LB培養液中，取1μl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

??

8.?陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送公司進行測序驗證。軟件比對測序結果并分析。
9.?質粒小提：
測序通過的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、?實驗結果
1.?PCR擴增目的片段：
用正向引物CAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATG（引物說明：含同源重組序列、Xho I酶切位點，并含有目的基因5’端配對序列用于PCR擴增目的基因），反向引物ATTCTGATCAGGATCCCTAAGTGCCACCAGACAGAAG（引物說明：含同源重組序列、BamH I酶切位點下劃線標記的，并含有目的基因3’端配對序列用于PCR擴增目的基因）對人基因組DNA進行擴增，預期PCR產物大小為339 bp，電泳結果如下：
???????????????????????????????????????????????????????? ?? 1????? 2

??????????????????????????????????????????????????????? ?

?

?

?

1.?PCR產物
2.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2.?表達載體的線性化：
用Xho I和BamH I對表達載體進行雙酶切，膠回收約11kb的載體片段，酶切圖譜如下：?

????????????????????????????????????????????????? 1?? 2

???????????????????????????????????????????????

?

?

1.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2.?載體線性化片段

3.?菌落PCR鑒定陽性克?。?br /> 用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物MIR30-F：ATGAGGCTTCAGTACTTTACAG位于目的基因多克隆位點的上游；反向引物WPRE-R：?? CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于目的基因下游的WPRE序列中。陽性克隆得到737bp條帶，空載體對照得到434bp。電泳結果如下：
?????????????????????????????????????????????????????? 1??? 2???? ?3??? ?4???? 5?? ?6???? ?7????? 8 ??? 9?? 10?? 11

???????????????????????????????????????????????????
1.? 陰性對照（ddH2O）
2.? 陰性對照（空載體）
3.? DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.? 挑取的8個轉化子
接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。測序沒有問題的，再接種抽提質粒。

4.?測序結果分析
黃色熒光標記的是hsa-mir-21的核心片段，紅色字體標記的是其上下游基因組序列
GTCGGGTCCAGCGATCTGCCATGACTCTCCCTCCACGCGCGTCCGGCCTGACATCGGCAGTTGGTCAGCGATGACGGCGCCGCCGATGGCGTCTGGACCACGCCCGAAGAGCGTCGAAGCGGGACGTGTTCGCCGAGATCGCTCGCGCCATGCCCGAGTGAGCCGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCTTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCTGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGTTTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATGCCTGGGTTTTTTTGGTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTATCAAATCCTGCCTGACTGTCTGCTTGTTTTGCCTACCATCGTGACATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCATGGCAACACCAGTCGATGGGCTGTCTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCATCCATATCCAATGTTCTCATTTAAACATTACCCAGCATCATTGTTTATAATCAGAAACTCTGGTCCTTCTGTCTGGTGGCACTTAGGGATCCTGATCAGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTTCAATTGGAAGACTAATGCGGCCGGCCATTACTCCGTCTCGTGTCTTGTTGCATATGTCTGCTGGTTTGTTTGATGTTGTTTGCGGGCGGGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCTAGGACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTGTGAAAGATTTACCTGGAAA

五、?參考文獻
1.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社
2.?Scherr M, Venturini L, Eder M. Lentiviral vector-mediated expression of pre-miRNAs and antagomiRs.Methods Mol Biol. 2010;614:175-185.
3.?Jia XQ, Cheng HQ, Qian X, et al. Lentivirus-mediated overexpression of microRNA-199a inhibits cell proliferation of human hepatocellular carcinoma. Cell Biochem Biophys. 2012 ;1: 237-244.

?