過表達(dá)miRNA構(gòu)建
產(chǎn)品名稱： 過表達(dá)miRNA構(gòu)建
英文名稱： MicroRNA expression vector construction
產(chǎn)品編號：
產(chǎn)品價格： 2200
產(chǎn)品產(chǎn)地： null
品牌商標(biāo)： null
更新時間： null
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?hsa-mir-21過表達(dá)載體構(gòu)建
摘要：以人基因組DNA為模板擴(kuò)增hsa-mir-21前體序列，并構(gòu)建入慢病毒載體pGIPZ。在該載體中hsa-mir-21前體序列被插入到tGFP以及puromycin抗性基因的3‘UTR區(qū)。tGFP利于后續(xù)的表達(dá)觀測， 而puromycin抗性基因則利于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。測序證實載體構(gòu)建成功，該載體既可用于瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可以包裝成慢病毒用于穩(wěn)定株的篩選以及在動物水平過表達(dá)hsa-mir-21。
關(guān)鍵詞：microRNA，過表達(dá)， hsa-mir-21， puromycin， lentivirus vector
一、?實驗原理
以人基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增hsa-mir-21基因前體序列，并構(gòu)建入慢病毒載體pGIPZ中。載體圖譜如下：
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二、?實驗?zāi)康?/strong>
構(gòu)建既可用于瞬時轉(zhuǎn)染又可用于穩(wěn)定株篩選的hsa-mir-21過表達(dá)慢病毒載體。
三、?實驗方法
以人基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增hsa-mir-21基因前體序列，并構(gòu)建入慢病毒載體pGIPZ中。表達(dá)載體酶切后回收線性化的載體片段。目的基因片段與線性化的載體片段經(jīng)同源重組后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序。測序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。
1.?引物設(shè)計：
從GenBank中查詢目的基因上下游的序列，用Vector NTI軟件進(jìn)行引物設(shè)計。
PCR擴(kuò)增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系和條件如下：
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2.?瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果：
目的片段PCR擴(kuò)增成功后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測①，通過和DNA Marker的對比，判斷目的片段是否擴(kuò)增成功。
3.?膠回收目的片段：
把目的片段條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4.?線性化表達(dá)載體的制備：
用限制性內(nèi)切酶對表達(dá)載體進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒2μg， 10 x反應(yīng)Buffer 5μl，限制性內(nèi)切酶各1μl，去離子水補足50μl，于37℃水浴鍋孵育2h以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?目的片段同源重組到線性化表達(dá)載體中：
將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2:1加到離心管中進(jìn)行重組反應(yīng)：
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混勻后在42℃孵育30min，然后轉(zhuǎn)移到冰上。放置2-3min后取10μl反應(yīng)液體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。
6.?感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化：
DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化，詳見《精編分子生物學(xué)實驗指南》。
7.?菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子：
挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μl LB培養(yǎng)液中，取1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。反應(yīng)體系和PCR循環(huán)條件如下：
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8.?陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送公司進(jìn)行測序驗證。軟件比對測序結(jié)果并分析。
9.?質(zhì)粒小提：
測序通過的陽性克隆，安排質(zhì)粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。
四、?實驗結(jié)果
1.?PCR擴(kuò)增目的片段：
用正向引物CAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATG（引物說明：含同源重組序列、Xho I酶切位點，并含有目的基因5’端配對序列用于PCR擴(kuò)增目的基因），反向引物ATTCTGATCAGGATCCCTAAGTGCCACCAGACAGAAG（引物說明：含同源重組序列、BamH I酶切位點下劃線標(biāo)記的，并含有目的基因3’端配對序列用于PCR擴(kuò)增目的基因）對人基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為339 bp，電泳結(jié)果如下：
???????????????????????????????????????????????????????? ?? 1????? 2
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1.?PCR產(chǎn)物
2.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
2.?表達(dá)載體的線性化：
用Xho I和BamH I對表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，膠回收約11kb的載體片段，酶切圖譜如下：?
????????????????????????????????????????????????? 1?? 2
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?
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1.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2.?載體線性化片段
3.?菌落PCR鑒定陽性克隆：
用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，正向引物MIR30-F：ATGAGGCTTCAGTACTTTACAG位于目的基因多克隆位點的上游；反向引物WPRE-R：?? CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于目的基因下游的WPRE序列中。陽性克隆得到737bp條帶，空載體對照得到434bp。電泳結(jié)果如下：
?????????????????????????????????????????????????????? 1??? 2???? ?3??? ?4???? 5?? ?6???? ?7????? 8 ??? 9?? 10?? 11
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1.? 陰性對照（ddH2O）
2.? 陰性對照（空載體）
3.? DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.? 挑取的8個轉(zhuǎn)化子
接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。測序沒有問題的，再接種抽提質(zhì)粒。
4.?測序結(jié)果分析
黃色熒光標(biāo)記的是hsa-mir-21的核心片段，紅色字體標(biāo)記的是其上下游基因組序列
GTCGGGTCCAGCGATCTGCCATGACTCTCCCTCCACGCGCGTCCGGCCTGACATCGGCAGTTGGTCAGCGATGACGGCGCCGCCGATGGCGTCTGGACCACGCCCGAAGAGCGTCGAAGCGGGACGTGTTCGCCGAGATCGCTCGCGCCATGCCCGAGTGAGCCGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCTTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCTGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGTTTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATGCCTGGGTTTTTTTGGTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTATCAAATCCTGCCTGACTGTCTGCTTGTTTTGCCTACCATCGTGACATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCATGGCAACACCAGTCGATGGGCTGTCTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCATCCATATCCAATGTTCTCATTTAAACATTACCCAGCATCATTGTTTATAATCAGAAACTCTGGTCCTTCTGTCTGGTGGCACTTAGGGATCCTGATCAGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTTCAATTGGAAGACTAATGCGGCCGGCCATTACTCCGTCTCGTGTCTTGTTGCATATGTCTGCTGGTTTGTTTGATGTTGTTTGCGGGCGGGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCTAGGACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTGTGAAAGATTTACCTGGAAA
五、?參考文獻(xiàn)
1.?F.M.奧斯伯等著，馬學(xué)軍等譯，精編分子生物學(xué)實驗指南（第四版），科學(xué)出版社
2.?Scherr M, Venturini L, Eder M. Lentiviral vector-mediated expression of pre-miRNAs and antagomiRs.Methods Mol Biol. 2010;614:175-185.
3.?Jia XQ, Cheng HQ, Qian X, et al. Lentivirus-mediated overexpression of microRNA-199a inhibits cell proliferation of human hepatocellular carcinoma. Cell Biochem Biophys. 2012 ;1: 237-244.
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