產品簡介

ClearV 488 Caspase-3活細胞檢測試劑盒包含ClearV 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制劑。ClearV 488 Caspase-3 Substrate基于Caspase-3/7活力檢測細胞凋亡，適用于熒光顯微觀察和流式細胞儀分析。

相較于其它基于FLICA分析的試劑盒，試劑盒內提供的Substrate在檢測Caspase-3/7活性的同時不會抑制完整細胞的凋亡過程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD識別序列的熒光DNA染料組成。Substrate最初無熒光，其會穿過細胞膜進入細胞質。在凋亡細胞中Caspase-3/7剪切Substrate釋放高親和性的DNA染料，這種染料遷移到細胞核標記DNA并發出明亮的綠色熒光。Substrate是雙功能的，既可以檢測Caspase-3/7活性，又能可視化細胞核在細胞凋亡進行中的形態學變化。ClearV染色可以進行甲醛固定并兼容后續免疫染色實驗。

光譜特性ClearV : Ex/Em=500/530nm（with DNA）

產品規格

組分信息

儲存條件

冰袋（wet ice）運輸。儲存于4ºC，至少可以儲存12個月。

注意事項

1. 細胞可用Hoechst 33342染料（推薦濃度1 μM）共染，使細胞核產生藍色熒光染色（Ex/Em=346/460 nm）。
2. ClearV 488染料可用甲醛固定，但與甲醇固定不兼容。
3. 經甲醛固定的ClearV 488染色細胞可用0.1% TritonX-100處理后進行后續染色，但這樣處理后的染色亮度可能會減弱。
4. 操作時請采取防護措施，穿防護服、戴一次性手套等。
5. 本產品僅用于科研。

使用說明

1. 實驗優化

下面提供的實驗步驟根據終點法檢測制度。ClearV 488 Substrate可進行細胞長時間孵育過程研究。細胞密度、底物濃度和抑制劑濃度可能需要優化。推薦底物濃度1-10 μM之間。細胞可在培養基、PBS或其他的緩沖液中孵育底物。對于貼壁細胞，建議更換新鮮含有底物的培養基，以防背景的不均一性。底物孵育后換液或洗滌細胞等操作可自由選擇。

1. 對照設定

推薦設定以下對照：

A. 陰性對照：不誘導凋亡的細胞

B. 陽性對照：誘導凋亡的細胞

C. 抑制劑對照：誘導細胞凋亡同時（或提前10-30 min）孵育Caspase-3/7抑制劑，最后再添加ClearV 488 Caspase-3底物。

1. 抑制劑對照

試劑盒中所提供的Caspase-3/7 抑制劑Ac-DEVD-CHO可用來確認Caspase-3/7依賴于ClearV 488的熒光信號。對于抑制劑對照，抑制劑的終濃度應至少是底物濃度的2倍（例如當使用5 μM ClearV 488底物時，Ac-DEVD-CHO濃度為10 μM）。添加底物前在室溫下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min，加入底物后，孵育液中繼續保留抑制劑。Ac-DEVD-CHO是可逆的競爭性抑制劑。對于某些細胞類型有效的Caspase-3/7 抑制劑需要使用不可逆的抑制劑，如Z-DEVD-FMK，或需要在凋亡誘導之前或誘導過程中添加抑制劑。

1. 流式細胞儀分析

1. 選擇合適的方法誘導細胞凋亡，未經處理的細胞樣本作為對照。
2. 對于貼壁細胞，實驗前先用胰蛋白酶或其他方法消化細胞。
3. 用細胞培養基或合適緩沖液重懸細胞，使細胞密度達到10⁶個/mL數量級。
4. 添加200 μL細胞懸液至流式細胞試管。
5. 抑制劑對照樣本，用Ac-DEVD-CHO處理細胞（見上文）。
6. 200 μL細胞懸液中加5 μL 0.2 mM的Substrate并立即混勻使底物濃度為5 μM。不同類型細胞最佳底物濃度可能不同，需進一步優化。
7. 室溫避光孵育15-30 min。
8. 加入300 μL細胞培養基或PBS，使用流式細胞儀分析，選擇檢測綠色熒光的通道（激發/發射：485/515 nm）。

1. 熒光顯微鏡觀察

1. 選擇合適的方法誘導細胞凋亡，未經處理的細胞樣本作為對照。
2. 抑制劑對照樣本，用Ac-DEVD-CHO 處理細胞（見上文）。
3. 用含5 μM Substrate的新鮮培養基或PBS對細胞進行換液（見試驗優化）。對于抑制劑對照組，抑制劑與底物一同孵育。
4. 室溫孵育30 min 或更長時間。
5. PBS或其它緩存液清洗細胞，熒光顯微鏡觀察細胞，使用觀察綠色熒光的濾片（激發/發射：485/515 nm）。

1. 熒光酶標儀檢測

1. 將貼壁細胞生長在黑色96孔板中；對于懸浮細胞，調整密度至10⁶個/mL，每孔加入0.2 mL細胞懸液。
2. 選擇合適的方法誘導細胞凋亡，未經處理的細胞樣本作為對照。

【注意】細胞可能在管或瓶中處理，然后轉移到96孔檢測板。

1. 抑制劑對照樣本，用Ac-DEVD-CHO處理細胞（見上文）。
2. 對于懸浮細胞，直接添加Substrate混勻。對于貼壁細胞，用含有5 μM Substrate的新鮮培養基或PBS對細胞進行換液（見試驗優化）。對于抑制劑對照組，抑制劑與底物一同孵育。
3. 細胞可以在含有Substrate的培養基中直接觀察。
4. 對于懸浮細胞，輕輕震蕩重懸細胞。熒光酶標儀設置激發波長488 nm和發射波長520 nm。建議貼壁細胞使用底部閱讀方式。貼壁細胞密度的變化可能導致不準確的讀數。