CO-IP檢測/WB檢測/ChIP/免疫組化/免疫熒光

CO-IP檢測

免疫共沉淀（Co-IP）主要原理是將純化的抗體直接固定在瓊脂糖基質上，從細胞裂解的液或其他復雜混合物中分離天然蛋白復合體。免疫共沉淀是研究蛋白：蛋白相互作用的一種常用方法，即利用抗體去免疫沉淀特定抗原（誘餌蛋白）并且共沉淀任何于該抗原相互作用的蛋白（目的蛋白）。

免疫共沉淀操作步驟

1、取 4℃保存的抗體固定柱，4℃ 1500 X g 離心 1min，棄濾液；

2、加入200μl IP裂解液洗滌離心柱，4℃ 1500 X g 離心 1min，棄濾液；

3、加入200μl預冷的 PBS洗滌離心柱，4℃ 1500 X g 離心 1min，棄濾液，于紙上吸干柱頭液體，塞緊塞子；

4、加入（使用對照瓊脂糖樹脂預處理細胞裂解液：4）保存的濾液，擰緊蓋子，4℃孵育3.5h；

5、安裝收集管，取下并保留塞子，旋松蓋子，4℃ 1500 X g 離心 1min，保留濾液；

6、加入200μl預冷的 PBS洗滌離心柱3次，4℃ 1500 X g 離心 1min，棄濾液；

7.安裝收集管，向離心柱中樹脂斜面加入10μl Elution Buffer，1500 X g 離心 1min，保存濾液；加入50μl Elution Buffer，室溫放置5min，1500 X g 離心 1min，保存濾液。

WB檢測

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

主要實驗步驟如下：?

總蛋白提取

（1）組織剪切成細小的碎片。每100mg組織加入1mL RIPA裂解液。用玻璃勻漿器勻漿20次。?

?（2）將勻漿物轉移到1.5 mL離心管。12,000rpm，4 oC離心5min，吸取上清，即可進行后續的電泳、Western或免疫沉淀操作。?

蛋白濃度測定（BCA測蛋白濃度）

檢測樣品的測定

檢測樣品測定時，同?BSA?標準品溶液同時進行測定。

（1）分別取100 μL檢測樣品（稀釋100倍）加入到微孔板中，每個樣品取2個平行樣進行測定。

（如果必要，也可選擇與BSA標準品溶液相同的稀釋方法稀釋檢測樣品后測定）????????????????????????

（2）加入100 μL工作液后，立即混勻。

（3）37℃水浴中反應60min后，冷卻至室溫。

（4）酶標儀波長設定在562nm?處進行測定。用水校零。盡可能在20min內檢測完畢所有樣品。

（5）各樣品溶液的吸光度值減去Blank值的平均值，根據標準曲線計算出檢測樣品的蛋白濃度。?????

SDS－PAGE電泳

（1）將長短玻璃板對齊后按照方向放入制膠夾中卡緊，然后垂直卡在制膠架子上準備灌膠。

（2）配制15％和10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將膠加至適量高度（綠線附近）后，輕柔加上雙蒸水壓膠。

（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用濾紙將水吸干。

（4）配制5％的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。

（5）待濃縮膠凝固后，將含膠的玻璃板加入電泳夾卡緊，放入電泳槽（電極紅對紅，黑對黑）。

染色質免疫共沉淀（ChIP）

染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是研究蛋白質與DNA相互作用的經典實驗方法。它是基于體內分析發展起來的方法，能真實、完整地反映結合在DNA序列上的調控蛋白，是目前確定與特定蛋白結合的基因組區域或確定與特定基因組區域結合的蛋白質的最好方法。隨著新一代測序技術的成熟與發展，整合了染色質免疫共沉淀與高通量測序技術的ChIP-Seq，是研究目標靶蛋白與DNA相互作用的又一技術突破，可應用于組蛋白特異性修飾位點、轉錄因子結合位點等的研究。

技術特點

全基因組覆蓋：?ChIP-Seq可在全基因組范圍對蛋白結合位點進行篩選與鑒定

高靈敏度：每個樣本可獲得數百萬條的序列標簽，可發現研究基因組上稀有的蛋白結合位點

高精確率：可獲得高水平的信噪比數據，準確區分真實事件與噪音，精確定位蛋白結合位點

高性價比：僅需較少的數據量即可鑒定全基因組范圍內的結合位點

免疫組化（IHC）

免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

免疫熒光

免疫熒光染色：主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗，在激光共聚焦系統下即可觀察到熒光。染色程序分為兩步，第一步，用已知未標記的抗體（Anti LC3II）加到未知抗原樣本上；第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體（Anti Alexa Fluor 647）。如果第一步發生了抗原抗體反應，熒光標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定抗原。

我公司可以提供單標、雙標及三標的免疫熒光服務。

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