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? ? 膀胱癌（BCa）作為全球最常見的惡性腫瘤之一，是男性癌癥相關死亡的主要原因，2018年估計新增55萬病例和2萬人死亡。BCa患者的預后與淋巴結（LN）轉移密切相關，其5年生存率從77.6%下降到18.6%，但是BCa中引發淋巴結轉移的分子機制仍不清楚。
?? 研究報道由腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）產生的VEGF-C在BCa淋巴管生成和淋巴結轉移中起重要作用。此外，PROX1對淋巴管系統的形成、調節內皮細胞的分化和誘導淋巴管內皮細胞的淋巴出芽和延伸也起到關鍵作用。然而，癌細胞促進淋巴管生成和PROX1上調的確切機制仍需要進一步探究。
?? 外泌體是一類粒徑大小為30-150nm的微小囊泡，內容物含有各種核酸組分，包括mRNAs、miRNAs、lncRNAs。最近有研究表明癌癥細胞分泌的外泌體是細胞間通訊的關鍵信使，與癌癥引起的血管通透性、炎癥等相關。
?? 近日，中山大學孫逸仙紀念醫院的林天歆課題組報道了一種lncRNA，LINC00858，被稱為淋巴結轉移相關轉錄物2（LNMAT2），在BCa組織中過表達，同時也在BCa患者的尿液外泌體（urinary-EXO）中大量富集，且與淋巴結轉移呈正相關。外泌體LNMAT2能在體內外促進淋巴管生成和LN轉移。機制上，裝載到外泌體中的LNMAT2與異質核糖核蛋白A2B1（hnRNPA2B1）直接相互作用，并被傳遞到人淋巴管內皮細胞（HLECs）。隨后，LNMAT2通過誘導hnRNPA2B1介導的H3賴氨酸4三甲基化（H3K4me3）與PROX1啟動子形成三聚體，增強PROX1轉錄，從而BCa中促進淋巴管生成和LN轉移。
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實驗結果

1.LNMAT2過表達與BCa淋巴結轉移相關
?? 作者通過二代測序（NGS）技術分別測不同組織中的lncRNAs表達情況，即5例BCa患者中高度肌肉侵襲性膀胱癌（MIBC組織）和癌旁組織（NATs），5對LN陽性和LN陰性的BCa組織。數據分析顯示，與NATs相比，LNMAT2在MIBC組織中表達增加了3倍以上；與LN陰性組織相比，LN陽性組織中LNMAT2表達也提高了3倍以上。隨后作者用266個BCa患者的膀胱癌組織和癌旁組織進行實時定量PCR（qRT-PCR），結果進一步證實了LNMAT2在膀胱癌組中呈現過表達現象。隨后，通過RACE、FISH等實驗對LNMAT2的特征進行闡述，LNMAT2位于染色體10q23.1，全長為3187nt，定位于BCa細胞的胞質中。
?? 此外，作者通過對266個BCa患者的檢測數據分析，發現BCa患者的LNMAT2表達與LN轉移呈正相關（Figure 1A）。Kaplan-Meier曲線分析揭示了LNMAT2過表達會使BCa患者有較短的總生存期(OS)和無病生存率（DFS）（Figure 1B-C）。原位雜交（ISH）結果表明LNMAT2在LN陽性的BCa組織中顯著上調，在LN陰性的BCa組織中有稍許增加，在NATs中幾乎檢測不出（Figure 1D-E）。重要的是，LNMAT2表達也與淋巴管密度呈正相關，可以用淋巴管內皮透明質酸受體1（LYVE-1）進行觀察，但是BCa中沒有看到LNMAT2和VEGF-C表達之間的相關性（Figure 1F-H）。

Figure 1 LNMAT2過表達與BCa淋巴轉移有相關性

2.LNMAT2在BCa細胞分泌的外泌體中富集
?? 由于胞外lncRNAs主要包裹在特定的亞細胞結構中，尤其是外泌體，且在介導細胞間相互作用和促進腫瘤淋巴結轉移方面具有重要的生物學功能，故作者檢測了BCa細胞分泌的外泌體中LNMAT2表達水平。作者用qRT-PCR分析了206例BCa患者和120例健康對照者的尿液樣本中分離的外泌體，發現與健康對照組相比，從BCa患者獲得的尿液EXO中LNMAT2水平上調(Figure 2A),這表明了外泌體LNMAT2對BCa的發展至關重要。
?? 隨后作者進一步檢測了從BCa細胞系(5637和UM-UC-3)的培養上清中分離的外泌體中LNMAT2的表達。為了證實從培養上清中分離得到的顆粒是外泌體，作者分別用透射電鏡（TEM）鑒定外泌體的杯狀形態（Figure 2B）、Nanosight分析外泌體的大?。‵igure 2C）和WB檢測外泌體的特定標志物（CD9和CD63）（Figure 2D）。在5637和UM-UC-3細胞系中LNMAT2表達顯著上調，同時LNMAT2在BCa細胞分泌的外泌體中富集量與細胞表達量相關，這揭示了LNMAT2主要以外泌體形式發揮其作用（Figure 2E）。過表達或干擾細胞中LNMAT2的表達同時會相應地上調或下調外泌體中LNMAT2的表達（Figure 2，H和I）?？傊?，上述結果表明了LNMAT2在BCa細胞分泌的外泌體中大量富集。

Figure 2 LNMAT2水平在BCa細胞分泌的外泌體中顯示上調

3.BCa細胞分泌的外泌體LNMAT2可在體外促進淋巴管生成
?? 作者將BCa細胞分泌的外泌體與HLECs細胞共孵育，檢測發現與對照組相比，BCa細胞分泌的外泌體能顯著促進HLEC的成管和遷移能力（Figure3，A-C）。由過表達LNMAT2細胞分泌的外泌體能強烈誘導HLEC的成管和遷移（Figure 3，D-F），而由干擾LNMAT2細胞分泌的外泌體失去了其誘導HLEC的成管和遷移的能力（Figure 3，G-I）。

Figure 3 外泌體LNMAT2能在體外促進淋巴管生成

4.外泌體LNMAT2能在體內促進淋巴轉移
?? 作者將luciferase標記的UM-UC-3細胞移植到裸鼠的腳墊處，并把裸鼠隨機分成3組，隨后進行瘤內注射，3組注射劑分別為PBS（control）、轉染了空載體的UM-UC-3細胞分泌的外泌體（UM-UC-3-EXOvector）、轉染了帶有LNMAT2的UM-UC-3細胞分泌的外泌體（UM-UC-3-EXOLNMAT2）。當原發腫瘤達到200mm3，切除腫瘤和腘窩淋巴結進行分析（Figure 4A）。結果發現，與對照組或UM-UC-3-EXOvector相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2能顯著提高BCa細胞向LNs轉移的能力（Figure 4，B和C）。UM-UC-3-EXOLNMAT2組中腘窩淋巴結的體積也比對照組或UM-UC-3-EXOvector大（Figure 4，D和E）。螢光素酶免疫染色實驗也表明了UM-UC-3-EXOLNMAT2組中外泌體的LNMAT2能提高BCa細胞向LNs轉移的能力（Figure 4，F和G）。

Figure 4 外泌體LNMAT2能在體內促進淋巴結轉移

?? 隨后，作者研究了外泌體LNMAT2的體內致瘤能力，即小鼠皮下接種UM-UC-3細胞，并將小鼠隨機分為3組，再向每組分別瘤內注射PBS、UM-UC-3-EXOvector和UM-UC-3-EXOLNMAT2，每3天注射一次，連續5周（Figure 5A）。結果發現，與UM-UC-3-EXOvector組和PBS組相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2促進了腫瘤的生長（Figure 5，B-D），體現在腫瘤的大小、重量及增殖marker Ki67的檢測上（Figure 5，E-H）。上述數據揭示了BCa細胞分泌的外泌體LNMAT2能在體內促進淋巴管生成和LN轉移。

Figure 5 外泌體LNMAT2能在體內促進BCa淋巴管生成

5.LNMAT2與hnRNPA2B1直接相互作用
?? 作者用RNA pull-down實驗獲得了一個明顯的35-40kDa條帶（Figure 6A），經質譜（MS）證實是hnRNPA2B1（Figure 6B），通過WB檢測也說明了LNMAT2特異地與hnRNPA2B1結合（Figure 6，C和D）。此外，LNMAT2FISH和hnRNPA2B1免疫染色實驗結果顯示了LNMAT2和hnRNPA2B1主要集中在BCa細胞的胞質中（Figure 6E）。RNA免疫沉淀（RIP）結果驗證了LNMAT2和hnRNPA2B1之間的相互作用（Figure 6F）。隨后通過序列分析進一步尋找到LNMAT2和hnRNPA2B1相互作用的區域（Figure 6K）。

Figure 6 LNMAT2與hnRNPA2B1直接相互作用

6.hnRNPA2B1介導LNMAT2包裝進外泌體
?? 作者想驗證LNMAT2與hnRNPA2B1之間的相互作用是否能促進LNMAT2包裝進外泌體，于是，作者將hnRNPA2B1敲低，發現BCa細胞分泌的外泌體LNMAT2水平降低，而BCa細胞中LNMAT2水平沒有變化。隨后，通過突變LNMAT2與hnRNPA2B1之間的結合位點，證明了hnRNPA2B1與這些結合位點之間的相互作用對于LNMAT2包裝成外泌體很重要（Figure 7B）。此外，與miR-18a相比，這是一種只在細胞中存在，而外泌體中沒有的miRNA，LNMAT2呈現了較高的外泌體-細胞的比率（Figure 7C）。hnRNPA2B1敲低后顯著降低了BCa細胞分泌的外泌體中LNMAT2和miR-98富集水平（Figure 7D），這表明了LNMAT2以hnRNPA2B1依賴的方式特異性地包裝進外泌體。
7.外泌體LNMAT2能被HLECs吸收并誘導其淋巴管生成
?? 作者將純化的外泌體進行PKH67綠色熒光標記，并與HLECs孵育12h。共聚焦圖片顯示受體細胞HLECs胞質中有綠色熒光信號，而對照組中沒有觀察到PKH67熒光信號（Figure 7E）。此外，作者發現HLECs與外泌體共孵育后，其LNMAT2表達顯著提高（Figure 7F）。
?? 作者用CRISPR/Cas9方法敲除了HLECs中LNMAT2，建立了LNMAT2-KO細胞系，再進行LNMAT2缺失檢測，表明內源性LNMAT2表達成功被抑制（Figure 7H）。隨后再考察外泌體LNMAT2對LNMAT2-WT和LNMAT2-KO細胞的影響，通過成管和Transwell實驗發現，與轉染了干擾對照組（si-NC）5637細胞分泌的外泌體(5637-EXOsi-NC)相比，轉染了si-LNMAT2#1的5637細胞分泌的外泌體能降低LNMAT2-KO HLEC的增殖和遷移（Figure 7，I-K）。上述這些結果表明，BCa細胞通過向HLECs傳遞外泌體LNMAT2來誘導淋巴管生成。

Figure 7LNMAT2以hnRNPA2B1依賴的方式包裝入外泌體中并傳遞到HLECs

8.外泌體LNMAT2獨立于VEGF-C上調PROX1表達
?? 之前的文獻報道了腫瘤細胞和TAMs產生的VEGF-C有助于BCa中淋巴管生成和LN轉移，然而，20%以上伴有淋巴結轉移的BCa呈低VEGF-C表達。作者的研究結果顯示，無論是LNMAT2過表達還是LNMAT2敲低，5637和UM-UC-3細胞中VEGF-C的mRNA或蛋白水平基本都沒有改變，這也說明了BCa中LNMAT2誘導的淋巴管生成和LN轉移可能通過一種獨立于VEGF-C的機制而發生的。
?? 有研究報道，PROX1通過調節內皮細胞分化和轉移，對淋巴管系統的發育比較重要。有趣的是，與對照組相比，用外泌體LNMAT2處理HLECs，其PROX1表達顯著提高（Figure 8，A和B），表明在HLECs中外泌體LNMAT2能上調PROX1表達。
9.外泌體LNMAT2能與PROX1啟動子形成DNA-RNA三聚體
?? 作者研究發現，外泌體LNMAT2大量富集到HLECs的細胞核中，隨后通過螢光素酶和CHIRP實驗證明了外泌體LNMAT2與HLECs中PROX1啟動子的P3（-607bp至-597bp）區域相互作用（Figure 8，C-F）。
?? 為了進一步研究LNMAT2是否直接與PROX1啟動子相互作用，作者使用LongTarget工具獲得了5對潛在的三聚體形式的寡核苷酸（TFOs）和它們對應的三聚體目標位點（TTSs），并且每個結合位置可以用熒光共振能量轉移（FRET）分析和圓二色性（CD）光譜檢測。經過多個實驗驗證，說明了外泌體LNMAT可通過與hnRNPA2B1直接作用以增強PROX1啟動子的H3K4me3水平，從而上調PROX1表達（Figure 8）。

Figure 8外泌體LNMAT2與PROX1啟動子形成一種DNA-RNA三聚體

10.外泌體LNMAT2與hnRNPA2B1相互作用，以促進PROX1啟動子處的H3K4三甲基化
?? 作者探討了HLECs中hnRNPA2B1是否通過調節PROX1啟動子區域的H3K4me3水平而參與外泌體LNMAT2誘導的PROX1轉錄激活。用5637-EXOLNMAT2、UM-UC-3-EXOLNMAT2和5637-EXOsi-LNMAT2#1分別處理HLECs，結合CHIP實驗，發現外泌體LNMAT能與hnRNPA2B1直接相互作用并增加PROX1啟動子區H3K4me3水平，從而上調PROX1表達水平。
11.外泌體LNMAT2誘導引起PROX1上調促進淋巴轉移
?? 接下來，作者減少外泌體中LNMAT2表達，會使腫瘤誘導的HLEC增殖、遷移功能隨之降低（Figure 9，A-C）。而干擾PROX1會顯著消除外泌體LNMAT2引起的HLEC成管和遷移現象，并且是獨立于VEGF-C的方式，因此，PROX1對于體外外泌體LNMAT2介導的獨立于VEGF-C而引起淋巴管生成和淋巴結轉移是必需的。此外，體內實驗表明，經過VEGF-C中和抗體處理后，與UM-UC-3-EXOvector組相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2組腘窩LNs體積更大（Figure 9，D-F）。小鼠BCa組織的IHC結果也說明了LNMAT2高水平時，腫瘤內和腫瘤周圍區域的LYVE-1陽性淋巴管中PROX1表達均升高（Figure 9，G-I）。這些數據進一步證明，外泌體LNMAT2上調PROX1表達，以VEGF-C無關的方式誘導BCa淋巴轉移。

Figure 9PROX1是外泌體LNMAT2介導的淋巴管生成所必需的

12.外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結轉移有關
?? 作者發現在另外206例患者的檢測中，LNMAT2過表達與BCa組織瘤內和瘤周圍區域淋巴管密度增加有關（Figure 10，A和B）。ISH結果顯示，當BCa患者中外泌體LNMAT2高表達時，腫瘤組織中LNMAT2水平也會顯著升高，這表明外泌體LNMAT2在與LNMAT2相關的BCa淋巴結轉移中起重要作用。隨后，作者考察外泌體LNMAT2是否與BCa淋巴結轉移相關。有淋巴結轉移的BCa患者的外泌體LNMAT2表達明顯高于無淋巴結轉移的BCa患者（Figure 10C）。此外，Kaplan-Meier分析顯示外泌體LNMAT2表達水平高與BCa的不良預后有關（Figure 10，D和E）。受試者工作特征曲線（ROC）分析顯示，尿液中的外泌體LNMAT2可區分BCa患者于健康對照組，且AUC曲線對于BCa淋巴結轉移的準確性判斷更高（Figure 10，F和G）。同時，作者也檢測了血清中外泌體LNMAT2水平，也發現LN轉移的BCa患者血清中外泌體LNMAT2表達顯著提高。綜上所述，作者的結果表明，外泌體LNMAT2可能是BCa患者LN轉移的一個潛在診斷標志物和治療靶點（Figure 10H）。

Figure 10外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結轉移有關

?? 和元生物一直致力為外泌體研究提供整體解決方案，從實驗設計、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體分子檢測到外泌體示蹤和體內外功能驗證，豐富的項目經驗、專業的科研團隊、優質的技術支持服務，為您的項目保駕護航！

結論：
?? 在本篇文章，作者發現了BCa中外泌體lncRNA介導了一個與VEF-C無關的LN轉移機制，并且鑒定LNMAT2可以作為BCa淋巴轉移的一個治療靶點。

參考文獻：
J Clin Invest.2020 Jan 2;130(1):404-421. Exosomal long noncoding RNA LNMAT2 promotes lymphatic metastasis in bladder cancer.



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