產品描述

Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發生。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合，可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

本試劑盒可用于流式細胞儀、熒光顯微鏡進行檢測。

產品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。-20℃避光保存，避免反復凍融，一年有效。

【注】：如果需要在短時間內多次重復使用，可以在4℃避光保存，半年有效。

注意事項

1）由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。

2） 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷；PI攝入過多，消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。

3）如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？?/span>以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

4）試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

5）Annexin V-FITC和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。

6）本產品僅作科研用途！

操作方法

1.1 樣品染色

1）懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞。

貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2）用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g，4℃離心5 min。收集1～5×10⁵細胞。

3）吸棄PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。

4）加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI Staining Solution，輕輕混勻。

5）避光、室溫反應10-15 min。

6）加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

【注】：為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

1.2 樣品分析

A．流式細胞儀分析：

FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），FITC為橫坐標，PI為縱坐標。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

B．熒光顯微鏡分析：

1）滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

【注】：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。

2）在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

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