產品介紹：

本試劑盒用于評估生物素標記的DNA的標記效率，所采用的方法是將標準品和待檢測樣品梯度點樣到尼龍膜，探針結合的生物素與鏈霉親和素-HRP結合，通過ECL化學發光，底片曝光或者ECL化學發光成像儀記錄灰度值，亦可以使用DAB或AEC沉淀型底物，根據灰度值的比對，估算出標記樣品的標記效率，標記效率低于30%為標記不合格。

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本試劑盒亮點：

1.?本試劑盒操作簡單，2小時可以完成標記效率測算

2.?試劑盒備齊所需的試劑組分，不需要額外準備其他的材料。

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試劑盒已經提供材料：

尼龍膜（8cm*12cm）?????? ????2塊

鏈霉親和素-HRP（1000X）? ????20ul

ECL化學發光底物A??????? ????2.5ml

ECL化學發光底物B???????? ???2.5ml

Biotin-DNA Control (10nM)?? ?200μl

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實驗室需要具備：

紫外交聯儀（254nm）或超凈工作臺紫外燈，或手提式紫外檢測儀（燈）；

化學發光CCD或膠片曝光暗室。

注意：如果實驗室沒有化學發光CCD或膠片曝光暗室可以選擇生物素DNA探針標記效率檢測試劑盒（DAB型）或生物素DNA探針標記效率檢測試劑盒（AEC型）

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其他需要自備試劑材料：

2??移液器及吸頭

2??PBS(pH 7.2)

2??去離子水

試劑盒儲存

鏈霉親和素-HRP和Biotin-DNA Control(10nM)在-20℃儲藏，其他組分4℃儲藏。

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試劑盒操作流程

1.???將10nM Biotin-DNA Control，用TE依次梯度稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM作為標準對照品;

2.???取2-3ul已經標記的的生物素標記DNA探針，用TE稀釋成10nM待檢測。取出適量的10nM生物素標記的DNA探針，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。

3.???取去試劑盒內尼龍膜,剪成合適大小，并做上標記，將以上步驟1和步驟2已經稀釋好的標準對照品和待測的生物素標記的DNA探針依次點在膜上，每個點位點2ul;可按下表的排列順序點膜。

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4.???按照上圖點樣后，充分自然晾干；

5.???紫外交聯儀或者紫外燈照射10分鐘,距離不少于10cm,如果沒有紫外燈或者交聯儀直接放在超凈工作臺。

6.???放入1% BSA-TBST中封閉半小時；

7.???加入鏈霉親和素-HRP工作液（使用前1:1000稀釋），結合半小時；

8.???TBST洗滌3次，每次3分鐘；

9.???取等體積ECL A組分和ECL B組分，混合后，滴加在膜上，立即膠片曝光或者化學發光成像儀記錄圖片。

10.??如果實驗室沒有化學發光成像記錄儀或者膠片曝光條件，可以選用DAB底物或者AEC底物顯色后。

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結果判讀與分析：

如果可以通過圖像讀取灰度數值，則可以建立Biotin-DNA Control的標準曲線，通過標準曲線計算待測Biotin-DNA探針濃度值，用計算得到的數值除以該點位DNA總量值，即可得到生物素標記效率；例如，通過標準曲線計算到待測Biotin-DNA探針第2個點的值為7.5fmol，那么7.5/10=75%,即標記效率為75%。

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如果沒有灰度分析儀，也可以通過肉眼觀察比對估算標記效率，如：待測Biotin-DNA探針第2個點的灰度與Biotin-DNA Control的第4個點灰度值相似，則待測Biotin-DNA探針第2個點實際的生物素標記DNA探針為2.5fmol，而待測Biotin-DNA探針第2個點的總DNA量為10fmol,所以，2.5/10=25%,，通過肉眼估算得到結果比較粗糙。

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注意事項：

1.???如果標記效率低于30%，用于后續檢測通常是不合格的。

2.???由于TdT可以催化DNA 3'端添加多個Biotin-11-dUTP,所以有時候，很可能測算出來的標記效率數值大于100%。