概述?

16S rDNA測序，作為一種應用于環境微生物菌落多樣性研究的靶標基因測序技術，通過針對覆蓋16SrDNA的1個或多個連續可變性區域進行PCR擴增測序來鑒定樣本微生物菌落成員和分析比較多樣本微生物菌落的結構， 454測序平臺以讀長優勢廣泛應用于16SrDNA測序應用領域，但是Illumina的Hiseq2500和MiSeq平臺可以針對16S rDNA的1個區域進行測序, 具有對樣本更高的測序深度、鑒定更多的低豐度群落成員且以較低的費用的優勢完成科研項目。

技術路線

生物信息學分析模塊

樣品要求

1． 樣品總量:>=5ug

2． 樣品濃度:>=50ng/ul

3． 樣品純度:OD值260/280應在1.8-2.0

4． 樣品質量:基因組完整、無降解、無污染

5． 樣品包裝:用封口膜密封樣品， DNA低溫運輸(-20°C)

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參考文獻

[1] J. Gregory Caporaso, Christian L. Lauber, William A. Walters, Donna Berg-Lyons, Catherine A. Lozupone, Peter J. Turnbaugh, Noah Fierer, and Rob Knight. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth ofmillions of sequences per sample.PNAS. 2010, Apr 30.

[2] Illumina Application Note.High-Speed, Multiplexed 16S Microbial Sequencing on the MiSeq System.

[3] J Gregory Caporaso,Christian L Lauber, William A Walters, Donna Berg-Lyons,James Huntley, Noah Fierer, Sarah M Owens, Jason Betley, Louise Fraser,Markus Bauer, Niall Gormley, Jack A Gilbert, Geoff Smith and Rob Knight. Ultra-high-throughput microbial community analysison the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. 2012,Jan 1.

[4] Patrick H Degnan and Howard Ochman. Illumina-based analysis of microbial communitydiversity.The ISME Journal.2012, Jun 16.

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應用案例

?Applied Enviromental Microbiology. 2011, Apr 1.

Generation of Multimillion-Sequence 16S rRNA Gene Librariesfrom Complex Microbial Communities by AssemblingPaired-End Illumina Reads.

Andrea K. Bartram, Michael D. J. Lynch, Jennifer C. Stearns, Gabriel Moreno-Hagelsieband Josh D. Neufeld.

背景

1． 針對實驗室培養的混合細菌系2個重復樣本和來自北極苔原土壤2個重復樣本利用Illumina 2×125 兩端測序平臺進行V3可變性區域測序，采用自己研發的兩端序列重疊組裝方法分別得到高質量的>1 million 和>6 million序列，生物信息學分析顯示兩個重復樣本間高度相似性和證實可以million數量級序列檢測到樣本中的低豐度細菌種類。

2． 實驗結果也提示可以利用多個標記和擴增16S rDNA不同可變性區域的引物序列能夠同時檢測多個樣本的微生物菌落。

研究方法

1． 2個實驗室培養的6個混合細菌系重復樣本和2個來自北極苔原土壤重復樣本分別抽提DNA

2． 修改后的341F和518R引物擴增V3區域，加標記接頭， Illumina測序

3． 兩端序列重疊組裝

4． 序列的物種分類單元注釋、操作分類單元OTU聚類和Good Coverage估計、

5.?? 利用Sanger測序數據驗證

分析結果

1．針對實驗室培養的混合細菌系2個重復樣本(C1、C2)和來自北極苔原土壤2個重復樣本(AT1、AT2)序列重疊組裝后的序列統計結果顯示C1和C2共1,306,630條， AT1和AT2共6,470,294條。

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2. 擴增V3區域測序列，兩端序列重疊組裝，然后利用OTU聚類和RDP注釋得到在門注釋水平上兩個重復樣本存在較高相似性， AT1和AT2相似性達到0.99， AT1和AT2分別與ATS(Sanger測序)達到0.95。

3．AT1和AT2樣本的細菌種類交集大部分是高豐度細菌種類，T1和AT2樣本特異的細菌種類大部分是低豐度細菌種類。

4．AT1和AT2兩樣本混合后的AT樣本Good Coverage估計值曲線顯示隨著隨機抽取的序列數增加，檢測到的操作分類單元OTU數增加最后達到幾乎飽和。

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