產品簡介

Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8屬于MTT的升級產品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物（formazan）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。CCK-8法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。

產品規格

運輸與儲存

2-8℃干燥避光儲存，有效期1年。-20℃干燥避光保存，有效期2年。冰袋運輸。

操作注意

1. 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。
2. 有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基液面下加，容易產生氣泡，會干擾OD值讀數。
3. 白細胞可能需要培養較長時間。
4. 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000 個/孔 (100 μL 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500個/孔 (100 μL 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。
5. 如果沒有450 nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度最高。
6. 培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
8. 本產品僅作科研用途！

操作說明

1. 制作標準曲線（測定細胞具體數量）

a）先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞到培養板內。

b）按比例（例如：1/2比例）依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。

c）接種后培養2-4 h使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8后的培養時間。）

1. 細胞活性檢測

a）在96孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養一段時間（37℃，5% CO₂）。

b）向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

c）將培養板在培養箱內孵育1-4 h。

d）用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

e）若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24 h內測定，吸光度不會發生變化。

1. 細胞增殖-毒性檢測

a）在96孔板中配制100 μL的細胞懸液。將培養板放在培養箱預培養24 h（37℃，5% CO₂）。

b）向培養板加入10 μL不同濃度的待測物質。

c）將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24或48 h）。

d）向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

e）將培養板在培養箱內孵育1-4 h。

f）用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

g）若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24 h內測定，吸光度不會發生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

1. 活力計算

細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力