性能

高度適用于表觀遺傳學研究的檢測工具

焦磷酸測序技術配合QIAGEN表觀遺傳學產品線，提供高度可靠的序列數據，能夠準確、靈敏的定量分析甲基化水平。甚至能夠檢測新的突變，以及低水平的DNA異常甲基化。PyroMark Q24包括了一個完整軟件包，用于分析CpG位點甲基化，以及用于確認亞硫酸氫鹽處理徹底與否的內置的對照。

定量分析單個CpG位點

分析單個CpG位點對于研究各種腫瘤基因的異常表達是非常重要的。由于傳統方法獲得的數據分辨率低，通常靈敏度不高。焦磷酸測序技術克服了這一局限，可高度精確地分析有一個或多個CpG位點的甲基化序列單個位點的變化。

原理

焦磷酸測序技術基于測序原理，數分鐘內可獲得定量數據。PyroMark Q24是提供實時測序信息的完整體系，高度適用于表觀遺傳學研究和遺傳分析。該系統包括PyroMark Q24、PyroMark Q24 Vacuum Workstation、PyroMark Q24 Software、PyroMark Gold Q24 Reagents、PyroMark Control Oligo和PyroMark Q24 Validation Oligo（見表）。同時提供樣本制備方案，可使用PyroMark 24 Vacuum Workstation制備單鏈DNA。

高度適用于遺傳分析的平臺

遺傳分析涵蓋多種分析基因組DNA差異的應用，包括突變檢測和SNP分型。PyroMark Q24可精確、高度靈敏地分析靶基因突變和定量分析混合細胞群體的等位基因頻率。QIAGEN采用焦磷酸測序技術為基因突變分析提供經優化和驗證的RUO檢測。

焦磷酸測序反應步驟：

步驟1：擴增DNA片段，作為焦磷酸測序模板的單鏈是生物素標記的。變性后，分離生物素標記的單鏈PCR擴增子，與測序引物雜交。雜交的引物和單鏈模板同各種酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和熒光素一起孵育。

步驟2：第一個脫氧核苷三磷酸（dNTP）加入反應中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP結合到DNA鏈上與其互補的堿基位。每次結合都會釋放與核苷酸相等摩爾量的焦磷酸（PPi）。

步驟3：在有APS的條件下，ATP硫酸化酶將PPi轉化為ATP。在這個ATP的驅動下，熒光素酶將熒光素轉化為氧化熒光素，并產生可見光，可見光的量與ATP的量成正比。通過電荷耦合（CCD）相機即可檢測到熒光素酶催化反應產生的可見光，并在原始數據輸出（Pyrogram）中顯示為一個峰，每個峰的高度（光信號）與結合的核苷酸數量成正比。

步驟4：三磷酸腺苷雙磷酸酶，是一種核苷酸降解酶，會降解未結合的核苷酸與ATP。完全降解后，加入另一個核苷酸。

步驟5：持續添加dNTP。α-硫代脫氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反應中用于替代天然脫氧腺苷三磷酸（dATP），這是因為DNA聚合酶可高效的應用前者，而不被熒光素酶識別。當該過程連續進行時，就會形成互補的DNA鏈，可根據Pyrogram追蹤的信號峰確定核苷酸序列。

簡化的工作流程—從樣本到結果

多功能PyroMark Q24與表觀遺傳學和遺傳學分析流程無縫接合，且與QIAGEN先進的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉化和PCR擴增技術兼容。借助于高度可靠的儀器可在測序水平上對CpG位點和突變進行檢測和定量分析。簡化的工作流程可更快速地獲得結果。

流程

快速方便的樣本制備

從PCR產物到直接用于測序的單鏈模板，應用PyroMark Q24 Vacuum Workstation可在15分鐘內同時制備24個樣本。該工作站操作簡單，且手動時間少于5分鐘。

在焦磷酸測序之前，形成了一個生物素標記的PCR產物，該產物結合到覆蓋鏈酶親和素的瓊脂糖凝膠珠上。這些膠珠會被真空儀器捕捉并徹底清洗，隨后變性，得到適合于焦磷酸測序的單鏈DNA。該模板DNA放入含測序引物的焦磷酸測序反應板中，隨后引物退火，再將該板放入PyroMark儀器中即可。PyroMark Gold試劑包含用于焦磷酸測序反應的酶、核苷酸和底物，將這些試劑加入分配吸頭或卡夾（取決于儀器），按照軟件中提供的體積，試劑被加入到儀器中，用于焦磷酸測序。

應用

焦磷酸測序技術對各個領域的研究應用至關重要。焦磷酸測序技術能夠靈敏的分析遺傳學和表觀遺傳學的變化，如檢測病原體中藥物抗性的發展，基因表達分析中表觀遺傳學DNA甲基化的作用、牲畜特異性表現型的遺傳標記，以及法醫檢材樣本中線粒體DNA的多態性。此外，由于焦磷酸測序技術整合了序列檢測和定量，提高了分析靈敏度，助于發現新的信息。

軟件

易于使用的PyroMark Q24軟件

安裝在電腦上的PyroMark Q24軟件能夠全面分析您的結果。該軟件包含兩個分析程序：CpG和AQ（等位基因定量）。兩個程序可在同一塊板上分析樣本，并且能夠同時檢測不同類型的樣本。AQ程序用于分析單個和多個位點，以及雙、三和四等位突變。CpG程序能夠分析多個連續的CpG位點，并提供亞硫酸氫鹽處理的內參。

使用PyroMark Assay Design Software，靈活、簡單的設計焦磷酸測序實驗

PyroMark Assay Design Software 2.0可簡單的設計PCR和測序引物。這些產品是經過優化的，可用于所有的PyroMark儀器。