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細胞介紹

THLE-3細胞系來源于人肝臟左葉的原代正常肝細胞，通過SV40大T抗原（SV40 large T antigen）感染實現永生化。具體過程是將含有SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段的逆轉錄病毒載體導入兼嗜性包裝細胞株PA317中生產病毒，進而感染正常肝細胞，從而建立THLE-3細胞系。THLE-2 和 THLE-3細胞系源自同一供體的正常肝左葉原代肝細胞，使用相同的逆轉錄病毒載體（含SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段），經PA317包裝細胞株生產病毒后感染肝細胞從而建立以上細胞系。THLE-3細胞表達正常成人肝上皮細胞的表型特征，如細胞角蛋白18（cytokeratin 18）和白蛋白（albumin），在對數生長期的高傳代細胞中也表達細胞角蛋白19（cytokeratin 19）。該細胞系具有接近二倍體的核型，不表達甲胎蛋白（alpha-fetoprotein），在無胸腺裸鼠中不成瘤。THLE-3細胞保留了與化學致瘤物代謝相關的酶，包括細胞色素P450途徑（cytochrome P450 pathways）、環氧化物水解酶（epoxide hydrolase）、NADPH細胞色素P450還原酶（NADPH cytochrome P450 reductase）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）、過氧化氫酶（catalase）、谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferases）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase）等，能夠將苯并[a]芘（benzo[a]pyrene）、N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine）和黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1）等化學致癌物代謝為最終致癌代謝物，這些代謝物可與DNA結合，因此THLE-3細胞是研究藥物毒理學和人肝細胞癌病原學及病理的體外模型。

細胞特性

1） 來源：肝; 左葉 用SV40大T抗原進行上皮永生化

2） 形態：上皮細胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數

4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運輸和保存

干冰運輸及復蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完全培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

細胞培養步驟

一．培養基及培養凍存條件準備

1）準備BEGM kit培養基  (Lonza/Clonetics，CC-3170)備注：培養基包含（A+B），ATCC 不使用 BEGM 試劑盒提供的 GA（慶大霉素-兩性霉素 B 混合物）,另向其中添加額外的 5 ng/mL  EGF、70 ng/mL 磷酸乙醇胺和 10% FBS。可根據實驗要求添加P/S雙抗，1%。

A： BEBM 基礎培養基  （貨號CC-3171）       500ML

B:  細胞生長添加劑    （貨號CC-4175）        一套（包含下列試劑）

● BPE, 2.0 ml ● Hydrocortisone, 0.5 ml    ● hEGF, 0.5 ml

● Epinephrine, 0.5ml  ● Insulin,0.5 ml      ● Transferrin, 0.5 ml

● Triiodothyronine, 0.5 ml ● Retinoic Acid, 0.5 ml ● GA, 0.5ml

ATCC上THLE-3細胞推薦上面的培養條件和試劑來培養該細胞，因市場長期斷貨，本公司用其它培養體系進行培養傳代驗證后已經穩定下來配方，該細胞培養體系較為特殊且較難培養，建議直接選擇訂購經我庫官網經優化和測試后可保持THLE-3細胞最佳生長狀態的THLE-3細胞的專用完全培養基，用于THLE-3細胞更換培養體系前過渡與保種。

產品主要成分如下

基礎培養基                                                 500mL

對應的細胞培養添加劑                             5mL

ITS(胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑)              5mL

FSB                                                              50mL

P/S青霉素-鏈霉素                                      5mL

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液配方：培養液（DMEM培養基+10%胎牛血清 ）92%，DMSO 8%

二．細胞處理

注意： 該細胞較難培養，在培養前建議對細胞培養瓶（皿）進行預包被用混合的0.01 mg/mL纖維連接蛋白、0.03 mg/mL牛膠原I型和0.01 mg/mL牛血清白蛋白。或使用Corning的cellbind細胞培養瓶,貨號是3289來進行培養細胞。

1）凍存細胞的復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。使用的瓶皿應 預涂 有0.01 mg/ml的纖維連接蛋白、0.03 mg/ml的牛膠原I型和0.01 mg/ml的牛血清白蛋白的混合物，溶解在BEBM培養基中。或使用Corning的cellbind細胞培養瓶,貨號是3289來進行培養細胞。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。 

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

下面T25瓶為例

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×10^7個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×10^7個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。