現在一般都采用亞磷酰胺化學合成Oligo DNA片段，具有高效、快速偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成時從3'→5'方向進行，通常3'端的第一個堿基結合在Glass擔體（Controlled Pore Glass，CPG）上。Oligo DNA合成的原理基本相同，主要差別在于合成產率的高低、試劑消耗量和單個循環用時的不同。我公司采用的合成儀主要機型為ABI3900高通量合成儀。

合成的詳細過程見圖1，現簡要說明如下：

圖1 Oligo DNA合成原理圖。N1代表第一個堿基，N2代表第二個堿基，依次類推。

? 第一步，三氯乙酸和預先連接在固相載體（CPG）上的第一個核苷酸反應（其活性基團處于被保護狀態），脫去核苷酸5‘-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5‘-羥基；

??? 第二步，活化新的堿基單體（Phosphoramidite)，準備與第一個堿基進行反應；

??? 第三步，合成DNA的原料（亞磷酰胺保護的核苷酸單體）與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3‘端被活化，5‘-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5‘-羥基發生縮合反應；

??? 第四步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5‘-羥基沒有參加反應(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉；

??? 第五步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。（即將三價磷氧化成五價磷)

（重復進行Step1～Step5的循環，直至合成完所需的Oligo DNA序列）???????

? 第六步，合成結束后，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進行進一步的純化。

合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。連接在CPG上的引物被切下來，通過, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮、脫鹽，測定OD260定量，根據定單要求分裝。

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