動物品種

SD大鼠

動物性別

雄性

動物規格

260-290g

造模方法

1.  體位：仰臥，固定

2.  備皮：剃毛、脫毛后進行術部消毒

3.  切口：頸部中線作縱向切口，約1cm

4.  鈍性分離頜下腺及其他筋膜組織，拉鉤牽引，暴露頸部兩側血管

5.  鈍性分離左頸總動脈與迷走神經。分離頸外與頸內動脈、迷走神經與舌咽神經。

6.  頸總動脈結扎活結，頸外動脈結扎2個死結，頸內動脈結扎活結。

7.  頸外動脈從近心端死結下開口，插入線栓，活結扎緊。

8.  頸外動脈2個死結間剪斷，牽引頸外動脈斷端向下，與頸內動脈呈直線。

9.  將線栓伸至頸內動脈中，打解開頸內動脈活結，插入線栓（260~280g大鼠,插入深度約17mm,280g以上的大鼠,插入深度約18mm），會微遇阻力(此時小鼠出現略微掙扎現象)。此時線栓頭端正好插入頸內動脈深部，固定線栓?？p合頸部切口，碘伏消毒，濕紗布覆蓋創口等待再灌注。

10.  大腦中動脈阻塞45min后，再次麻醉，拔出線栓，結扎頸外動脈殘端；

11.  解開頸總動脈活結，即可實現再灌注。 縫合，消毒，等待小鼠蘇醒。

成模鑒定

（一）卒中動物腦血流測定

1.激光多普勒流量測定（LDF）

2. 激光散斑血流測定 (LSCI)：血流下降至術前70%-80%說明模型成功

3.磁共振腦血流測定

4.同步輻射血管造影

（二）常用卒中動物功能評估方法

● 朗格法-神經功能缺陷評分：5分制評分在動物麻醉清醒后24h進行(評分1-3分的小鼠，MCAO模型制備的成功性更可靠)

● 神經損害嚴重程度評分：卒中動物研究中最常見的神經學量表之一是改良后的神經損害嚴重程度評分(modified neurological severity score，mNSS)。mNSS 的滿分為14 或18 分，取決于測試對象是小鼠或大鼠。mNSS 包括運動(肌肉狀態和異常運動)感覺(視覺、觸覺和本體感受)、反射和平衡測試。不能執行其中 1項測試得 1分，而沒有相應測試反射扣1分,整體的綜合評分用來確定損害程度。神經學評分可以評估多種神經缺陷，并能在損傷后 30~60 d 的時間內進行測試。盡管測試任務很簡單，但評分可能是特定于某種形式或神經功能的，并可能被綜合得分所掩蓋。此外，在 mNSS 中測試的反射是耳郭和驚恐反射，這些測試項目不太可能與大腦中動脈供血區域的損傷有關。

注：無法完成其中一項任務或其中一項反射缺失則給予1分。13~18 分提示嚴重損害；7~12 分,中度損害；1~6 分，輕度損害。

（三）  組織學檢測

1.  TTC染色（氯化三苯基四氮唑染色）

2.  HE染色

造模周期

3d

后續檢測指標建議

腦組織TTC染色、伊文思藍染色

注意事項

1.  術后實驗動物的飼養和管理

保溫：手術后的動物放置在一個單獨的恢復籠子中,籠子的一半應該置于溫度合適的電熱板上。

補液：術后通過腹腔、靜脈或皮下注射給予溫暖(即體溫)液體可以幫助動物維持血壓，加快術后麻醉恢復，也可以緩解因長時間手術操作導致的脫水和血容量不足。

飼養：MCAO 術后動物會有恢復期頸部疼痛和不適的問題，常規鼠籠需要動物仰頭進食和飲水,但對于術后動物而言仰頭動作會造成較大的疼痛。因此,飼養術后動物需要將鼠糧和飲水放置到更容易取食的地方。常規的顆粒飼料比較硬，可以適當泡軟后提供給術后動物。

觀察：術后每隔 10~15 min 觀察一次，直至動物能夠行走。術后至少連續3 天觀察動物是否出現食欲下降、過于興奮或安靜傷口延遲愈合、感染等跡象，每天至少觀察并記錄 1次。直至動物正常飲水攝食，轉至常規飼養。

2.  手術過程中保證小鼠體溫在 37°C，缺血時的溫度會影響梗死體積的生成，溫度過低，會由于低溫保護作用，造成梗死灶體積過小或每只模型梗死體積不一致；而溫度過高會加重腦損傷，導致梗死體積過大，動物容易死亡。

3.  術后應該怎樣具體護理才能降低小鼠死亡率？

術后抗感染：手術后大多數動物死亡會源于術后感染，所以抗感染是重要的護理環節。首先切口周圍應嚴格用碘伏消毒，消毒范圍不應低于1.5 cm；同時，從術后當天開始，每天腹腔注射4萬單位青霉素，連續注射7天；術后生活的籠具墊料也應進行嚴格的消毒滅菌，墊料需每天更換一次。

術后鎮痛：術后切口強烈的疼痛，也是實驗動物死亡因素之一。在縫合傷口后，可以選擇性的以 2.5 mg/kg標準于小鼠尾靜脈注射曲馬多，以達到鎮痛目的。

術后飲食：MCAO術后1周內，為死亡高發期，其中一個重要的原因就是術后自主進食不佳。術后應采用流食，可 以喂養奶粉，或用10%蔗糖代替。如若1天內小鼠仍沒有進食行為，可以采用灌胃處理。

環境溫度：術后飼養的環境溫度應在 27°C±0.5°C，不宜過高，過高會出現灌注流速太大引起的腦出血，濕度為 70%±5%，通風良好，避免噪聲及動物間的相互干擾。

4.  死亡原因：解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網膜下腔出血，如有出血，表明死因是進拴太深，以后注意插線深度；如無出血，則還要再看是否有嚴重的大腦半球水腫，如腦水腫嚴重，則表明死因是腦缺血時間太長，需要縮短缺血時間

5.  插栓時死亡原因：

a）麻醉劑量過深；

b）窒息：呼吸道分泌物增多，操作時壓迫小鼠的氣管及分離血管時損傷迷走神經，導致小鼠窒息死亡。

c）手術過程中失血過多：包括分離頸部血管時出血、血管破裂出血、血管夾閉不全出血、線栓頭脫落出血、反復多次插入線栓出血等。

 拔栓時死亡原因：

a）線栓已經插破血管，拔線時導致大出血；

b）拔栓時頸外動脈沒有結扎好，導致大出血；

c）再灌注會加重小鼠的大腦損傷，小鼠無法承受。

6.  缺血時間與梗死部位的關系。

紋狀體比大腦皮層對缺血更為敏感，缺血30分鐘內僅在紋狀體梗塞，而缺血超過一個小時才會同時損傷紋狀體和皮層。如果造模后發現僅出現紋狀體梗死可能是線拴的深度不夠，或者是缺血再灌注的時間過短，可以通過調整線拴深度或增加缺血時間來預防。

7.  永久損傷與暫時性損傷的區別

永久性缺血損傷是在腦缺血后不進行拔栓，而短暫性損傷在腦缺血60min，90min或者120min后有一個拔栓血液再灌注的過程。

判斷標準：1）測腦血流：使用激光散斑血流成像系統測定小鼠兩側大腦的血流量。永久性損傷的缺血大腦血流不會恢復，比正常對側要低很多。短暫性損傷的缺血大腦再灌注后血流能夠恢復到對側的80%左右。2）TTC染色：永久損傷的缺血性大腦損傷面積大，短暫性損傷的缺血性大腦損傷區域固定在皮層和紋狀體之間。3）行為學：永久損傷的小鼠死亡率很高，行為學無法恢復。短暫性損傷的小鼠在缺血后期（14-28天）行為學能夠在一定的程度上恢復正常。