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動(dòng)物品種

SD大鼠

動(dòng)物性別

雄性

動(dòng)物規(guī)格

260-290g

造模方法

1.  體位：仰臥，固定

2.  備皮：剃毛、脫毛后進(jìn)行術(shù)部消毒

3.  切口：頸部中線作縱向切口，約1cm

4.  鈍性分離頜下腺及其他筋膜組織，拉鉤牽引，暴露頸部?jī)蓚?cè)血管

5.  鈍性分離左頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)。分離頸外與頸內(nèi)動(dòng)脈、迷走神經(jīng)與舌咽神經(jīng)。

6.  頸總動(dòng)脈結(jié)扎活結(jié)，頸外動(dòng)脈結(jié)扎2個(gè)死結(jié)，頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎活結(jié)。

7.  頸外動(dòng)脈從近心端死結(jié)下開口，插入線栓，活結(jié)扎緊。

8.  頸外動(dòng)脈2個(gè)死結(jié)間剪斷，牽引頸外動(dòng)脈斷端向下，與頸內(nèi)動(dòng)脈呈直線。

9.  將線栓伸至頸內(nèi)動(dòng)脈中，打解開頸內(nèi)動(dòng)脈活結(jié)，插入線栓（260~280g大鼠,插入深度約17mm,280g以上的大鼠,插入深度約18mm），會(huì)微遇阻力(此時(shí)小鼠出現(xiàn)略微掙扎現(xiàn)象)。此時(shí)線栓頭端正好插入頸內(nèi)動(dòng)脈深部，固定線栓。縫合頸部切口，碘伏消毒，濕紗布覆蓋創(chuàng)口等待再灌注。

10.  大腦中動(dòng)脈阻塞45min后，再次麻醉，拔出線栓，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端；

11.  解開頸總動(dòng)脈活結(jié)，即可實(shí)現(xiàn)再灌注。 縫合，消毒，等待小鼠蘇醒。

成模鑒定

（一）卒中動(dòng)物腦血流測(cè)定

1.激光多普勒流量測(cè)定（LDF）

2. 激光散斑血流測(cè)定 (LSCI)：血流下降至術(shù)前70%-80%說(shuō)明模型成功

3.磁共振腦血流測(cè)定

4.同步輻射血管造影

（二）常用卒中動(dòng)物功能評(píng)估方法

● 朗格法-神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：5分制評(píng)分在動(dòng)物麻醉清醒后24h進(jìn)行(評(píng)分1-3分的小鼠，MCAO模型制備的成功性更可靠)

● 神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)分：卒中動(dòng)物研究中最常見的神經(jīng)學(xué)量表之一是改良后的神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)。mNSS 的滿分為14 或18 分，取決于測(cè)試對(duì)象是小鼠或大鼠。mNSS 包括運(yùn)動(dòng)(肌肉狀態(tài)和異常運(yùn)動(dòng))感覺(jué)(視覺(jué)、觸覺(jué)和本體感受)、反射和平衡測(cè)試。不能執(zhí)行其中 1項(xiàng)測(cè)試得 1分，而沒(méi)有相應(yīng)測(cè)試反射扣1分,整體的綜合評(píng)分用來(lái)確定損害程度。神經(jīng)學(xué)評(píng)分可以評(píng)估多種神經(jīng)缺陷，并能在損傷后 30~60 d 的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。盡管測(cè)試任務(wù)很簡(jiǎn)單，但評(píng)分可能是特定于某種形式或神經(jīng)功能的，并可能被綜合得分所掩蓋。此外，在 mNSS 中測(cè)試的反射是耳郭和驚恐反射，這些測(cè)試項(xiàng)目不太可能與大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域的損傷有關(guān)。

注：無(wú)法完成其中一項(xiàng)任務(wù)或其中一項(xiàng)反射缺失則給予1分。13~18 分提示嚴(yán)重?fù)p害；7~12 分,中度損害；1~6 分，輕度損害。

（三）  組織學(xué)檢測(cè)

1.  TTC染色（氯化三苯基四氮唑染色）

2.  HE染色

造模周期

3d

后續(xù)檢測(cè)指標(biāo)建議

腦組織TTC染色、伊文思藍(lán)染色

注意事項(xiàng)

1.  術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和管理

保溫：手術(shù)后的動(dòng)物放置在一個(gè)單獨(dú)的恢復(fù)籠子中,籠子的一半應(yīng)該置于溫度合適的電熱板上。

補(bǔ)液：術(shù)后通過(guò)腹腔、靜脈或皮下注射給予溫暖(即體溫)液體可以幫助動(dòng)物維持血壓，加快術(shù)后麻醉恢復(fù)，也可以緩解因長(zhǎng)時(shí)間手術(shù)操作導(dǎo)致的脫水和血容量不足。

飼養(yǎng)：MCAO 術(shù)后動(dòng)物會(huì)有恢復(fù)期頸部疼痛和不適的問(wèn)題，常規(guī)鼠籠需要?jiǎng)游镅鲱^進(jìn)食和飲水,但對(duì)于術(shù)后動(dòng)物而言仰頭動(dòng)作會(huì)造成較大的疼痛。因此,飼養(yǎng)術(shù)后動(dòng)物需要將鼠糧和飲水放置到更容易取食的地方。常規(guī)的顆粒飼料比較硬，可以適當(dāng)泡軟后提供給術(shù)后動(dòng)物。

觀察：術(shù)后每隔 10~15 min 觀察一次，直至動(dòng)物能夠行走。術(shù)后至少連續(xù)3 天觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)食欲下降、過(guò)于興奮或安靜傷口延遲愈合、感染等跡象，每天至少觀察并記錄 1次。直至動(dòng)物正常飲水?dāng)z食，轉(zhuǎn)至常規(guī)飼養(yǎng)。

2.  手術(shù)過(guò)程中保證小鼠體溫在 37°C，缺血時(shí)的溫度會(huì)影響梗死體積的生成，溫度過(guò)低，會(huì)由于低溫保護(hù)作用，造成梗死灶體積過(guò)小或每只模型梗死體積不一致；而溫度過(guò)高會(huì)加重腦損傷，導(dǎo)致梗死體積過(guò)大，動(dòng)物容易死亡。

3.  術(shù)后應(yīng)該怎樣具體護(hù)理才能降低小鼠死亡率？

術(shù)后抗感染：手術(shù)后大多數(shù)動(dòng)物死亡會(huì)源于術(shù)后感染，所以抗感染是重要的護(hù)理環(huán)節(jié)。首先切口周圍應(yīng)嚴(yán)格用碘伏消毒，消毒范圍不應(yīng)低于1.5 cm；同時(shí)，從術(shù)后當(dāng)天開始，每天腹腔注射4萬(wàn)單位青霉素，連續(xù)注射7天；術(shù)后生活的籠具墊料也應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的消毒滅菌，墊料需每天更換一次。

術(shù)后鎮(zhèn)痛：術(shù)后切口強(qiáng)烈的疼痛，也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡因素之一。在縫合傷口后，可以選擇性的以 2.5 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)于小鼠尾靜脈注射曲馬多，以達(dá)到鎮(zhèn)痛目的。

術(shù)后飲食：MCAO術(shù)后1周內(nèi)，為死亡高發(fā)期，其中一個(gè)重要的原因就是術(shù)后自主進(jìn)食不佳。術(shù)后應(yīng)采用流食，可 以喂養(yǎng)奶粉，或用10%蔗糖代替。如若1天內(nèi)小鼠仍沒(méi)有進(jìn)食行為，可以采用灌胃處理。

環(huán)境溫度：術(shù)后飼養(yǎng)的環(huán)境溫度應(yīng)在 27°C±0.5°C，不宜過(guò)高，過(guò)高會(huì)出現(xiàn)灌注流速太大引起的腦出血，濕度為 70%±5%，通風(fēng)良好，避免噪聲及動(dòng)物間的相互干擾。

4.  死亡原因：解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網(wǎng)膜下腔出血，如有出血，表明死因是進(jìn)拴太深，以后注意插線深度；如無(wú)出血，則還要再看是否有嚴(yán)重的大腦半球水腫，如腦水腫嚴(yán)重，則表明死因是腦缺血時(shí)間太長(zhǎng)，需要縮短缺血時(shí)間

5.  插栓時(shí)死亡原因：

a）麻醉劑量過(guò)深；

b）窒息：呼吸道分泌物增多，操作時(shí)壓迫小鼠的氣管及分離血管時(shí)損傷迷走神經(jīng)，導(dǎo)致小鼠窒息死亡。

c）手術(shù)過(guò)程中失血過(guò)多：包括分離頸部血管時(shí)出血、血管破裂出血、血管夾閉不全出血、線栓頭脫落出血、反復(fù)多次插入線栓出血等。

 拔栓時(shí)死亡原因：

a）線栓已經(jīng)插破血管，拔線時(shí)導(dǎo)致大出血；

b）拔栓時(shí)頸外動(dòng)脈沒(méi)有結(jié)扎好，導(dǎo)致大出血；

c）再灌注會(huì)加重小鼠的大腦損傷，小鼠無(wú)法承受。

6.  缺血時(shí)間與梗死部位的關(guān)系。

紋狀體比大腦皮層對(duì)缺血更為敏感，缺血30分鐘內(nèi)僅在紋狀體梗塞，而缺血超過(guò)一個(gè)小時(shí)才會(huì)同時(shí)損傷紋狀體和皮層。如果造模后發(fā)現(xiàn)僅出現(xiàn)紋狀體梗死可能是線拴的深度不夠，或者是缺血再灌注的時(shí)間過(guò)短，可以通過(guò)調(diào)整線拴深度或增加缺血時(shí)間來(lái)預(yù)防。

7.  永久損傷與暫時(shí)性損傷的區(qū)別

永久性缺血損傷是在腦缺血后不進(jìn)行拔栓，而短暫性損傷在腦缺血60min，90min或者120min后有一個(gè)拔栓血液再灌注的過(guò)程。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：1）測(cè)腦血流：使用激光散斑血流成像系統(tǒng)測(cè)定小鼠兩側(cè)大腦的血流量。永久性損傷的缺血大腦血流不會(huì)恢復(fù)，比正常對(duì)側(cè)要低很多。短暫性損傷的缺血大腦再灌注后血流能夠恢復(fù)到對(duì)側(cè)的80%左右。2）TTC染色：永久損傷的缺血性大腦損傷面積大，短暫性損傷的缺血性大腦損傷區(qū)域固定在皮層和紋狀體之間。3）行為學(xué)：永久損傷的小鼠死亡率很高，行為學(xué)無(wú)法恢復(fù)。短暫性損傷的小鼠在缺血后期（14-28天）行為學(xué)能夠在一定的程度上恢復(fù)正常。