用兔抗LF的多克隆抗體包被成固相酶標板，以識別并結合待測標本中的LF,用抗原標記生物素（Bio-Ag），用親和素標記辣根酶(HRP-A)，向固相酶標板中同時加入標準品（或待測品）和Bio-Ag，兩者競爭性的結合到固相抗體上，反應、洗滌后，加入HRP-A，反應、洗滌后，酶標板上形成Ab-Ag-Bio-A-HRP和Ab-Ag復合物，加酶底物顯色，用酶標儀在相應波長下測定光密度（OD值），根據標準曲線，計算出待測標本中的LF含量。

試劑盒組成

1.? 真空包裝96孔固相酶標板一塊。

2.??????? 凍干的標準品7瓶：分別用標準稀釋液1.0mL溶解，濃度為0、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0μg/mL 。

3.? 生物素化抗原（Bio-Ag）1瓶：5mL。

4.? 酶結合物1管：20μl，用前每μl加緩沖液1mL稀釋。

5.? HRP-A 稀釋液 1 瓶：10mL。

6.? 顯色劑：A為凍干品：2瓶，B為液體：2瓶。 臨用前1瓶A加1瓶B溶解。

7.? 終止液1瓶：5mL。

8.? 洗滌液1瓶：用前用蒸餾水20倍稀釋。

9.? 實驗緩沖液 1 瓶：10 mL

注意事項

1 操作??? ⑴為保證實驗結果的準確性，標準品必須做雙孔；條件允許的情況下標準、質控、樣品均應做雙孔。 ⑵為防止樣品蒸發，試驗時應將反應板鋪于有濕布的密閉盒內。⑶血清、枸櫞酸鹽或EDTA抗凝血漿均可檢測，但血清或血漿中殘存凝塊或紅細胞須經離心去除。⑷標本在2-8℃可貯存3天，超過3天應放入-20℃，避免反復凍融。 ⑸分別用加樣器頭吸取每份標本，避免相互交叉。⑹底物易于氧化且對光敏感，一定要用前配置，用后的底物液必須棄去，不可再用。⑺顯色時室溫應在20-25℃。

2 試劑盒儲存條件??? ⑴試劑盒所有試劑均儲存于4℃。⑵酶標板在真空條件下可存放6個月，打開后若不能一次用完，請裝于密封性好的袋子內，于4℃干燥處保存，并在一個星期內使用。⑶標準品溶解后于4℃保存可使用一個月。⑷Bio-Ag、HRP-A每次吸取時應盡量避免污染，4℃保存可使用6個月。若液體出現渾濁則活性不可再用。

樣品準備

取靜脈血分離血清，待測；如不立即測量，可將樣本密封后，置于2~8℃或-20℃儲存備測，2~8℃保存不應超過48小時，-20℃保存不超過2個月。

操作步驟

1. ELISA測定LF操作步驟見下表：? 加樣量（μl）

操作完后用酶聯儀在490nm波長測量各孔OD值。

2 計算 ⑴用酶標儀上的ELISA自動分析軟件對所測OD值進行處理，選雙對數法繪制曲線，直接得出樣品濃度。⑵以標準物濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應濃度。

本試劑盒的技術參數

1 靈敏度：本測定法靈敏度為0.1μg/mL。

2 精密度：用本法同時及不同時間檢測8份樣品，批內變異系數7.4，批間變異系數為6.3。

3 準確度：⑴該抗血清與CRP（10μg/mL）、 巨球蛋白(270mg/mL)、 a 1-AT（81 μg /mL）均無交叉反應。⑵向已知濃度血清中加入定量的LF抗原測定回收率，其低濃度回收率為93.8 , 高濃度回收率為103.3 。

正常參考值

正常獻血員血清樣品80份測得正常參考值： 0.255-0.621μg/mL。

建議各實驗室應根據條件建立自己的正常對照組。