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圖 A. 未經(jīng)喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的Jurkat 細(xì)胞，用Annexin V-PE 和7-AAD雙染后流式二維圖（左）與直方圖（右）；

圖 B. 用終濃度為4 μM 的喜樹(shù)堿誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞凋亡4 h，用Annexin V-PE 和7-AAD雙染后流式二維圖（左）以及直方圖（右）。

圖2. Annexin V-PE/7-AAD染色檢測(cè)不同程度凋亡

用喜樹(shù)堿（Camptothecin，CPT）誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞（人T淋巴瘤細(xì)胞）凋亡，誘導(dǎo)濃度分別為0、4、8、12、16μM，分別誘導(dǎo)4小時(shí)后，參照產(chǎn)品說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖2。

(A)0μM. (B)4μM.(C)8μM.(D)12μM.(E)16μM.(F)競(jìng)爭(zhēng)封閉實(shí)驗(yàn)，采用16μM CPT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞4小時(shí)后，參照說(shuō)明書收集并洗滌細(xì)胞，于染色前加入無(wú)染料標(biāo)記的Annexin V蛋白孵育10分鐘，再進(jìn)行Annexin V-PE/7-AAD染色。無(wú)染料標(biāo)記的Annexin V結(jié)合了細(xì)胞上的PS，再進(jìn)行染色時(shí)，Annexin V-PE無(wú)法結(jié)合PS，這說(shuō)明了染色的特異性。

在正常細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由內(nèi)側(cè)外翻至外側(cè)，從而將PS暴露于細(xì)胞外部環(huán)境。Annexin V是一種35 - 36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

將Annexin V以藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的Annexin V保留了與PS的高親和力，可作為探針，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。由于在凋亡早期即發(fā)生PS外翻，故Annexin V-PE染色在凋亡早期就能識(shí)別出凋亡的發(fā)生。7-氨基放線菌素(7-AAD)是一種核酸染料，7-AAD不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，但可穿透膜損傷細(xì)胞如晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，可用來(lái)區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。因此將Annexin V-PE與7-AAD進(jìn)行共染，就可以區(qū)分不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。

本試劑盒所有組分均在2 - 8℃保存，Annexin V-PE和7-AAD Staining Solution需避光保存，勿冷凍。